Bruke kylling chorioallantoic membran i Vivo modell for å studere gynekologiske og urologiske kreftformer

Summary

Vi presenterer kylling korioallantoisk membran modell som et alternativ, transplanterbar, in vivo modell for engraftment av gynekologiske og urologiske kreft cellelinjer og pasient-avledede svulster.

Abstract

Musemodeller er referansetestene for in vivo kreftstudier. Kostnader, tid og etiske hensyn har imidlertid ført til krav om alternative kreftmodeller. Kylling korioallantoisk membran (CAM) modellen gir et billig, raskt alternativ som tillater direkte visualisering av tumorutvikling og er egnet for in vivo imaging. Som sådan forsøkte vi å utvikle en optimalisert protokoll for å fengsle gynekologiske og urologiske svulster i denne modellen, som vi presenterer her. Omtrent 7 dager etterbefruktning flyttes luftcellen til den vaskualiserte siden av egget, hvor en åpning opprettes i skallet. Svulster fra murine og menneskelige cellelinjer og primærvev kan deretter bli transplantert. Disse er vanligvis seeded i en blanding av ekstracellulær matrise og medium for å unngå cellulær spredning og gi næringsstøtte til cellene rekrutterer en vaskulær forsyning. Svulster kan da vokse i opptil 14 dager før eggene klekkes. Ved å implantere celler som er stabilt transducert med firefly luciferase, kan bioluminescensavbildning brukes til sensitiv påvisning av tumorvekst på membranen og kreftcellen spredt over hele embryoet. Denne modellen kan potensielt brukes til å studere tumorigeniitet, invasjon, metastase og terapeutisk effektivitet. Kylling CAM-modellen krever betydelig mindre tid og økonomiske ressurser sammenlignet med tradisjonelle murine modeller. Fordi eggene er immunkompromitterte og immuntolerante, kan vev fra enhver organisme potensielt implanteres uten kostbare transgene dyr (f.eks. mus) som kreves for implantering av humant vev. Imidlertid kan mange av fordelene med denne modellen potensielt også være begrensninger, inkludert kort tumorgenerasjontid og immunkompromittert / immuntolerant status. I tillegg, selv om alle tumortyper presentert her engraft i kylling chorioallantoic membran modell, gjør de det med varierende grad av tumorvekst.

Introduction

Mus har fungert som den klassiske modellorganismen for studiet av menneskelige sykdommer, inkludert malignitet. Som pattedyr deler de mange likheter med mennesker. Deres høye grad av genetisk likhet har tillatt transgen manipulering av musegenomet for å gi enorm innsikt i den genetiske kontrollen av menneskelige sykdommer¹. Lang erfaring i håndteringen av og eksperimentering med mus har resultert i at de er modellen for valg for biomedisinsk forskning. Men i tillegg til de etiske og vitenskapelige bekymringene om murine modeller, kan de også være ganske kostbart og tidkrevende^2,3. Utviklingen av svulster kan ta uker eller måneder. Boligen på en typisk institusjon alene kan kjøre i hundrevis til tusenvis av dollar mens svulster utvikler seg. Eggstokkreft er et eksempel på denne ulempen fordi veksten i murine modeller lett kan ta måneder. Forsinkelser i forskningsfremgang påvirker potensielt eggstokkreftpasienters vedvarende lave 5-årige overlevelsesrate på bare 47 % (dvs. en økning i overlevelse på bare 10 % over 30 år)⁴. Tilsvarende utgjør urologiske kreftformer (nyre-, prostata- og blærekreft) 19% av alle krefttilfeller i USA og 11% av kreftrelaterte dødsfall⁴. Dermed kan en ny in vivo tilnærming til å studere gynekologiske og urologiske kreftformer spare et laboratorium betydelig tid, arbeidskraft og penger, selv om denne modellen bare brukes til innledende screeningeksperimenter. I tillegg kan den resulterende akselerasjonen av forskningsfunn påvirke de 177.000 personene diagnostisert med disse kreftene årlig.

Kylling CAM modellen tilbyr mange fordeler som løser de nevnte problemene. En populær modell for å studere angiogenese^5,6, tumorcelleinvasjon^7,8, og metastase^7,9, chick embryo CAM modellen har allerede blitt brukt til å studere mange former for kreft, inkludert glioma^10,11,12, hode og nakke plateepitelkarsinom^13,14, leukemi^15,16, bukspyttkjertelkreft¹⁷, og kolorektal kreft¹⁸. I tillegg har CAM-modeller blitt generert for neuroblastom¹⁹, Burkitt lymfom²⁰, melanom²¹og feline fibrosarcoma²². Tidligere studier har også presentert engraftment av blærekreft²³ og prostatakreft cellelinjer²⁴, men med begrensede protokolldetaljer. Ikke bare er egg mye billigere enn mus, men de produserer også svært reproduserbare resultater^25,26. De viser rask vaskulaturutvikling, og tumorengraftment kan oppstå så raskt som noen få dager og visualiseres langsgående gjennom det åpne vinduet. Med 21 dagers tidsramme mellom eggbefruktning og klekking, kan eksperimenter fullføres i løpet av få uker. Videre tillater de lave kostnadene, begrensede boligbehov og små størrelse lett store eksperimenter som ville være uoverkommelige for musestudier.

Derfor forsøkte vi å optimalisere CAM-modellen for engraftment av gynekologiske og urologiske kreftformer. På grunn av den immunkompromitterte statusen til det tidlige kyllingembryoet²⁷, kan både mus og menneskelige celler lett implanteres. Som sådan har vi med hell engrafted ovarie-, nyre-, prostata- og blærekreft. For hver av disse tumortypene aksepterer CAM lett etablerte murine- og/eller humane tumorcellelinjer. Viktigere, nyhøstet primære menneskelige tumorvev kan også engraft fra enten fordøyd celler eller biter av solid vev med høye priser på suksess. Hver av disse krefttyper og cellekilder krever optimalisering, som vi deler her.

Protocol

Alle eksperimentene som presenteres her ble gjennomgått og godkjent av de riktige etiske komiteene ved University of California, Los Angeles (UCLA). Bruken av avidentifiserte, primære menneskelige svulster er godkjent av UCLA Institutional Review Board (protokollnummer 17-000037, 17-001169 og 11-001363). Ved UCLA er Animal Research Committee gjennomgang ikke nødvendig for eksperimenter ved hjelp av kyllingembryoer; protokollgodkjenning er bare nødvendig når eggene vil bli klekket ut. Imidlertid ble beste praksis, so…

Representative Results

Så langt har vi funnet denne metoden for implantasjon for å lykkes for ovarie-, nyre-, prostata- og blærekreft. Hver ble optimalisert for å identifisere spesifikke forhold for implantasjon, selv om det kan være fleksibilitet. Av de testede tumortypene var ovariekreftveksten mye mindre uttalt og vanligvis ikke synlig uten hjelp av bioluminescensavbildning (figur 1). Imidlertid kan en stivning av CAM merkes med tang innen implantasjon. Dette kan bidra til …

Discussion

Tumorutvidelse og engraftment ved hjelp av CAM-modellen tillater raskere og direkte observerbar tumorvekst enn eksisterende in vivo dyremodeller. I tillegg er kostnadene betydelig lavere når det første kjøpet av utstyr er fullført, spesielt sammenlignet med kostnadene for immunkompromitterte mus. Den første, immunkompromitterte tilstanden av kyllingembryoer tillater lett engraftment av humant og mininvev. Selv med disse styrkene har CAM-modellen begrensninger. Den korte tiden som kan være en fordel kan også være …

Materials

-010 Teflon (PTFE) White 55 Duro Shore D O-Rings	The O-Ring Store	TEF010	Nonstick ring for cell seeding. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Polytetrafluoroethylene (PTFE).
C4-2	ATCC	CRL-3314	Human prostate cancer cell line.
CWR22Rv1			CWR cells were the kind gift of Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California)
Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51)	Novus Biologicals	NBP2-44929-0.02mg	Used at a dilution of 1:100 for immunohistochemical analysis of human ovarian CAM tumors.
D-Luciferin Firefly, potassium salt	Goldbio	LUCK-1G
Delicate Operating Scissors; Curved; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4-3/4 in. Overall Length	Roboz Surgical	RS6703	This is provided as an example. Any similar curved scissors would work as well.
Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit	Dremel	8050-N/18	This kit contains all necessary tools.
Fertilized chicken eggs (Rhode Island Red – Brown, Lab Grade)	AA Lab Eggs Inc.	N/A	A local egg supplier would need to be identified, as this supplier only delivers regionally.
HT-1376	ATCC	CRL-1472	Human bladder cancer cell line.
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit	Incubator Warehouse	HB1588D-NONE-1102-1588-1357	Other egg incubators may be used, but their reliability would need to be verified. After implantation, a cell incubator with the CO2 disabled may also be used.
ID8			Not commercially available, please see PMID: 10753190.
Incu-Bright Cool Light Egg Candler	Incubator Warehouse	1102	Other candlers may be used; however, this is preferred among those that we have tested. This candler is included in the aforementioned incubator kit.
Iris Forceps, 10cm, Curved, Serrated, 0.8mm tips	World Precision Instrument	15915	This is provided as an example. Any similar curved forceps would work as well. Multiple brands have been used for this method.
Isoflurane	Clipper Distributing	0010250
IVIS Lumina II In Vivo Imaging System	Perkin Elmer
Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free	Corning	354248	Extracellular matrix solution
MyC-CaP	ATCC	CRL-3255	Murine prostate cancer cell line.
Portable Pipet-Aid XP Pipette Controller	Drummond Scientific	4-000-101	Any similar pipet controller would be appropriate.
PrecisionGlide Hypodermic Needles	BD	305196	This is provided as an example. Any 18G needle would work similarly.
RENCA	ATCC	CRL-2947
Semken Forceps	Fine Science Tools	11008-13	This is provided as an example. Any similar forceps or another style that suits researcher preference would be appropriate.
SKOV3	ATCC	HTB-77	Human ovarian cancer cell line.
Specimen forceps	Electron Microscopy Sciences	72914	This is provided as an example. The forceps used for pulling away the shell for bioluminescence imaging are approximately 12.8 cm long with 3 mm-wide tips.
Sterile Cotton Balls	Fisherbrand	22-456-885	This is provided as an example. Any sterile cotton balls would suffice.
Stirring Rods with Rubber Policeman; 5mm diameter, 6 in. length	United Scientific Supplies	GRPL06	This is provided as an example. Any similar glass stir rods would work as well.
T24	ATCC	HTB-4	Human bladder cancer cell line.
Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4"	Moore Medical	21272
Tissue Culture Dishes, 10 cm diameter	Corning	353803	This is provided as an example. Any similar, sterile 10-cm dish may be used. Tissue culture treatment is not necessary.
Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet)	Tygon	AACUN017	This is provided as an example. Any similarly sized tubing would work as well.