Utilisation du modèle De membrane chorioallantoïque de poulet In Vivo pour étudier les cancers gynécologiques et urologiques

Summary

Nous présentons le modèle chorioallantoic de membrane de poulet comme modèle alternatif, transplantable, in vivo pour l’engraftment des lignes gynécologiques et urologiques de cellules cancéreuses et des tumeurs patient-dérivées.

Abstract

Les modèles de souris sont les tests de référence pour les études sur le cancer in vivo. Cependant, le coût, le temps et les considérations éthiques ont donné lieu à des appels en faveur de modèles alternatifs de cancer in vivo. Le modèle de membrane chorioallantoïque de poulet (CAM) fournit une alternative peu coûteuse et rapide qui permet la visualisation directe du développement de tumeur et est approprié pour l’imagerie in vivo. En tant que tel, nous avons cherché à développer un protocole optimisé pour engrafting des tumeurs gynécologiques et urologiques dans ce modèle, que nous présentons ici. Environ 7 jours après la fécondation, la cellule d’air est déplacée vers le côté vascularisé de l’œuf, où une ouverture est créée dans la coquille. Les tumeurs des lignées cellulaires et des tissus primaires de la murine et de l’homme peuvent alors être greffées. Ceux-ci sont généralement enseisés dans un mélange de matrice extracellulaire et de milieu pour éviter la dispersion cellulaire et fournir un soutien nutritionnel jusqu’à ce que les cellules recrutent un approvisionnement vasculaire. Les tumeurs peuvent alors croître jusqu’à 14 jours supplémentaires avant l’éclosion des œufs. En implantant des cellules transmises de façon stable à la luciférase luciferase luciferase, l’imagerie par bioluminescence peut être utilisée pour la détection sensible de la croissance tumorale sur la membrane et la propagation des cellules cancéreuses dans l’ensemble de l’embryon. Ce modèle peut potentiellement être employé pour étudier la tumorigénicité, l’invasion, la métastes, et l’efficacité thérapeutique. Le modèle CAM de poulet nécessite beaucoup moins de temps et de ressources financières par rapport aux modèles murins traditionnels. Étant donné que les œufs sont immunodéprimés et tolérants au système immunitaire, les tissus de n’importe quel organisme peuvent potentiellement être implantés sans animaux transgéniques coûteux (p. ex. souris) requis pour l’implantation de tissus humains. Cependant, beaucoup des avantages de ce modèle pourraient potentiellement également être des limitations, y compris le temps court de génération de tumeur et le statut immunocompromis/immune tolérant. En outre, bien que tous les types de tumeur présentéicis ici engraft dans le modèle de membrane chorioallantoic de poulet, ils le font avec des degrés variables de croissance de tumeur.

Introduction

Les souris ont servi d’organisme modèle classique pour l’étude des maladies humaines, y compris la malignité. En tant que mammifères, ils partagent de nombreuses similitudes avec les humains. Leur degré élevé de similitude génétique a permis la manipulation transgénique du génome de la souris pour fournir un aperçu énorme dans le contrôle génétique des maladies humaines¹. Une vaste expérience dans la manipulation et l’expérimentation avec des souris a abouti à leur être le modèle de choix pour la recherche biomédicale. Cependant, en plus des préoccupations éthiques et scientifiques concernant les modèles murins, ils peuvent également être très coûteux et prendre beaucoup de temps^2,3. Le développement des tumeurs peut prendre des semaines, voire des mois. Le logement à une institution typique seul peut fonctionner dans les centaines à des milliers de dollars tandis que les tumeurs se développent. Le cancer de l’ovaire est un exemple de cet inconvénient parce que sa croissance dans les modèles murins peut facilement prendre des mois. Les retards dans les progrès de la recherche peuvent avoir un impact sur le faible taux de survie à 5 ans des patients atteints d’un cancer de l’ovaire, qui n’est que de 47 % (c.-à-d. une augmentation de la survie de seulement 10 % sur 30 ans)⁴. De même, les cancers urologiques (cancers du rein, de la prostate et de la vessie) représentent 19 % de tous les cas de cancer aux États-Unis et 11 % des décès liés au cancer⁴. Ainsi, une nouvelle approche in vivo pour étudier les cancers gynécologiques et urologiques pourrait faire économiser beaucoup de temps, de travail et d’argent à un laboratoire, même si ce modèle n’est appliqué qu’aux premières expériences de dépistage. De plus, l’accélération des résultats de la recherche qui en résulterait pourrait avoir un impact important sur les 177 000 personnes diagnostiquées avec ces cancers chaque année.

Le modèle CAM de poulet offre de nombreux avantages qui répondent aux problèmes susmentionnés. Un modèle populaire pour étudier l’angiogenèse^5,6, invasion de cellules tumorales^7,8, et métastasie⁷,^9,le modèle CAM embryon poussin a déjà été utilisé pour étudier de nombreuses formes de cancers, y compris le gliome^10,11,12, la tête et le cou carcinome épidermoïde^13,14, leucémie^15,16, cancer du pancréas¹⁷, et cancer colorectal¹⁸. En outre, les modèles de CAM ont été produits pour le neuroblastome¹⁹, le lymphome de Burkitt^20,le mélanome^21,et le fibrosarcome félin^22. Des études antérieures ont également présenté l’engraftment du cancer de la vessie²³ et les lignées cellulaires du cancer de la prostate²⁴, mais avec des détails limités de protocole. Non seulement les œufs sont beaucoup moins chers que les souris, mais ils produisent aussi des résultats très reproductibles^25,26. Ils montrent le développement rapide de vascularisation, et l’engraftment de tumeur peut se produire en aussi rapidement que quelques jours et être visualisé longitudinalement par la fenêtre ouverte. Avec le délai de 21 jours entre la fécondation des œufs et l’éclosion, les expériences peuvent être terminées en quelques semaines. En outre, le faible coût, les besoins limités en matière de logement et la petite taille permettent facilement des expériences à grande échelle qui seraient prohibitives pour les études sur les souris.

Par conséquent, nous avons cherché à optimiser le modèle de CAM pour l’engraftment des cancers gynécologiques et urologiques. En raison de l’état immunocompromis de l’embryon de poulet au début²⁷, la souris et les cellules humaines peuvent être facilement implantés. En tant que tel, nous avons réussi à greffer des cancers de l’ovaire, du rein, de la prostate et de la vessie. Pour chacun de ces types de tumeur, le CAM accepte facilement les lignées de cellules murines et/ou humaines établies de cellules de tumeur. Fait important, les tissus tumoraux humains primaires fraîchement récoltés peuvent également s’engrafter à partir de cellules digérées ou de morceaux de tissu solide avec des taux élevés de succès. Chacun de ces types de cancer et sources cellulaires nécessite une optimisation, que nous partageons ici.

Protocol

Toutes les expériences présentées dans les présentes ont été examinées et approuvées par les comités d’éthique appropriés de l’Université de Californie à Los Angeles (UCLA). L’utilisation des tumeurs humaines humaines primaires et identifiées a été approuvée par le conseil institutionnel d’examen de l’UCLA (numéros de protocole 17-000037, 17-001169, et 11-001363). À l’UCLA, l’examen du Comité de recherche sur les animaux n’est pas nécessaire pour les expériences utilisant des embryons de poulet; l’a…

Representative Results

Jusqu’ici, nous avons trouvé cette méthode d’implantation pour être réussie pour des cancers ovariens, de rein, de prostate, et de réservoir souple. Chacun a été optimisé pour identifier des conditions spécifiques pour l’implantation, bien qu’il puisse y avoir flexibilité. Parmi les types de tumeurs testés, la croissance du cancer de l’ovaire était beaucoup moins prononcée et généralement non visible sans l’aide de la formation image de bioluminescence (<strong class="xfig"…

Discussion

L’expansion et l’engraftment de tumeur utilisant le modèle de CAM permettent une croissance plus rapide et directement observable de tumeur que les modèles animaux in vivo existants. En outre, les coûts sont significativement plus faibles une fois l’achat initial de l’équipement est terminé, surtout par rapport au coût des souris immunocompromised. L’état initial et immunocompromis des embryons de poulet permet facilement l’engraftment du tissu humain et murine. Malgré ces atouts, le modèle CAM a des limites. Le…

Materials

-010 Teflon (PTFE) White 55 Duro Shore D O-Rings	The O-Ring Store	TEF010	Nonstick ring for cell seeding. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Polytetrafluoroethylene (PTFE).
C4-2	ATCC	CRL-3314	Human prostate cancer cell line.
CWR22Rv1			CWR cells were the kind gift of Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California)
Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51)	Novus Biologicals	NBP2-44929-0.02mg	Used at a dilution of 1:100 for immunohistochemical analysis of human ovarian CAM tumors.
D-Luciferin Firefly, potassium salt	Goldbio	LUCK-1G
Delicate Operating Scissors; Curved; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4-3/4 in. Overall Length	Roboz Surgical	RS6703	This is provided as an example. Any similar curved scissors would work as well.
Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit	Dremel	8050-N/18	This kit contains all necessary tools.
Fertilized chicken eggs (Rhode Island Red – Brown, Lab Grade)	AA Lab Eggs Inc.	N/A	A local egg supplier would need to be identified, as this supplier only delivers regionally.
HT-1376	ATCC	CRL-1472	Human bladder cancer cell line.
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit	Incubator Warehouse	HB1588D-NONE-1102-1588-1357	Other egg incubators may be used, but their reliability would need to be verified. After implantation, a cell incubator with the CO2 disabled may also be used.
ID8			Not commercially available, please see PMID: 10753190.
Incu-Bright Cool Light Egg Candler	Incubator Warehouse	1102	Other candlers may be used; however, this is preferred among those that we have tested. This candler is included in the aforementioned incubator kit.
Iris Forceps, 10cm, Curved, Serrated, 0.8mm tips	World Precision Instrument	15915	This is provided as an example. Any similar curved forceps would work as well. Multiple brands have been used for this method.
Isoflurane	Clipper Distributing	0010250
IVIS Lumina II In Vivo Imaging System	Perkin Elmer
Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free	Corning	354248	Extracellular matrix solution
MyC-CaP	ATCC	CRL-3255	Murine prostate cancer cell line.
Portable Pipet-Aid XP Pipette Controller	Drummond Scientific	4-000-101	Any similar pipet controller would be appropriate.
PrecisionGlide Hypodermic Needles	BD	305196	This is provided as an example. Any 18G needle would work similarly.
RENCA	ATCC	CRL-2947
Semken Forceps	Fine Science Tools	11008-13	This is provided as an example. Any similar forceps or another style that suits researcher preference would be appropriate.
SKOV3	ATCC	HTB-77	Human ovarian cancer cell line.
Specimen forceps	Electron Microscopy Sciences	72914	This is provided as an example. The forceps used for pulling away the shell for bioluminescence imaging are approximately 12.8 cm long with 3 mm-wide tips.
Sterile Cotton Balls	Fisherbrand	22-456-885	This is provided as an example. Any sterile cotton balls would suffice.
Stirring Rods with Rubber Policeman; 5mm diameter, 6 in. length	United Scientific Supplies	GRPL06	This is provided as an example. Any similar glass stir rods would work as well.
T24	ATCC	HTB-4	Human bladder cancer cell line.
Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4"	Moore Medical	21272
Tissue Culture Dishes, 10 cm diameter	Corning	353803	This is provided as an example. Any similar, sterile 10-cm dish may be used. Tissue culture treatment is not necessary.
Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet)	Tygon	AACUN017	This is provided as an example. Any similarly sized tubing would work as well.