原発性歯槽上皮細胞におけるmRNA転写物の安定性の研究のための効率的な転写制御プラスミド発現システム
Summary
ここでは、ピペットエレクトロポレーション技術に結合した誘導発現系を用いて、一次肺胞上皮細胞における転写物の転写後変調を研究するために使用できるツールを提示する。
Abstract
転写後の調節を研究することは、与えられたメッセンジャーRNA(mRNA)の変調と細胞恒常性および代謝への影響を理解するための基本である。実際、トランスクリプト発現の変動は、翻訳効率と最終的にはトランスクリプトの細胞活動を変える可能性があります。mRNAの半減期を調べるいくつかの実験的アプローチが開発されているが、これらの方法のいくつかは、転写後変調の適切な研究を妨げる限界がある。プロモーター誘導系は、テトラサイクリン調節促進剤の制御下で目的の遺伝子を発現することができる。この方法は、細胞恒常性を乱すことなく、任意の実験条件下での与えられたmRNAの半減期推定を可能にする。この方法の大きな欠点の1つは、従来のトランスフェクション技術に対して非常に耐性のある単離プライマリ細胞でのこの技術の使用を制限するトランスフェクト細胞の必要性である。初等培養における肺胞上皮細胞は、肺胞上皮の細胞および分子生物学を研究するために広く使用されてきた。原発性肺胞細胞のユニークな特徴と表現型は、これらの細胞に関心のある遺伝子の転写後の調節を研究することを不可欠にします。そこで、我々の目的は、一次培養における肺胞上皮細胞に関心のあるmRNAの転写後変調を調査するための新しいツールを開発することであった。我々は、転写制御されたプラスミド発現系を原発性肺胞上皮細胞に挿入するための迅速かつ効率的な一時的なトランスフェクションプロトコルを設計した。このクローニング戦略は、ウイルスエピトープを使用して構築物にタグを付け、内因性mRNAの構造発現から容易に識別することを可能にする。改変ΔΔ定量サイクル(Cq)法を用いて、転写物の発現を異なる時間間隔で定量して半減期を測定することができる。我々のデータは、原発性肺胞上皮細胞における様々な病態生理学的状態における転写後調節を研究する上で、この新しいアプローチの効率を示している。
Introduction
mRNAの半減期を決定するためにいくつかの技術が開発された。標識された mRNA を利用するパルス追跡減衰技術は、最小限の細胞妨害で mRNA の大きいプールの同時評価を可能にする。しかし、このアプローチは、単一の遺伝子転写物の半減期の直接的な推定を可能にせず、成長因子、ROS、アリン、または炎症1を伴う刺激後のmRNAの転写後変調を研究するために実施することができない。
アクチノマイシンDやα-アマニチンなどの転写阻害剤の使用は、mRNA分解動態を時間の経過とともに測定するための比較的簡単な方法です。以前の技術(パルスチェイス)に対するこのアプローチの主な利点の1つは、所定のトランスクリプトの半減期を直接推定し、異なる治療法がその劣化キネティクスにどのような影響を与えるかを比較する能力に依存しています。しかしながら、転写阻害剤が細胞生理学に及ぼす重大な有害な影響は、アプローチ2の大きな欠点を表す。実際、これらの薬剤による全細胞転写物の阻害は、マイクロRNA(miRNA)などのmRNA安定性に関与する主要元素の合成を摂氏化する悪影響を及ぼし、また、mRNA分解および安定性にとって重要なRNA結合タンパク質の発現および合成を妨げる悪影響を及ぼす。したがって、これらの薬物による遺伝子転写の重度の摂動は、実際にトランスクリプトの分解曲線を変更する可能性がある。
プロモーター誘導系は、特定のmRNAの半減期を測定する第3のアプローチを表す。この方法は、転写阻害剤を使用する方法と同様の方法で特定のmRNAの分解を測定する。2種類の誘導系が頻繁に使用される:血清誘発c-fosプロモーター3およびTet-Off誘導システム4.c-fosシステムでは、細胞に有毒であり得る転写阻害剤の使用は必要ない。しかし、この方法では細胞周期同期が必要であり、これは、フェーズ間5の間に転写物の実際の安定性の評価を防ぐ。対照的に、Tet-Offシステムは、目的の遺伝子(GOI)の強力な発現を、テトラサイクリン調節促進剤の制御下で可能にする。このシステムは、機能するために細胞にコトランスフェクションする必要がある2つの要素の存在を必要とします。第1のプラスミド(pTet-Off)は、ウイルスタンパク質HSV VP16から3つの転写トランス活性化ドメインに融合した原核代圧抑制剤TetR(大腸菌由来)で構成されるハイブリッド合成転写因子である調節タンパク質tTA-Advを発現する。GOIは、合成プロモーター(PTight)の制御下でpTRE-Tightプラスミドにクローン化され、テトオオペレータ配列の7回の繰り返しに融合したサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターの最小配列を含む。PTightの下流の遺伝子の転写は、テトオとテトアの相互作用に依存する。テトラサイクリンまたはその誘導体の存在下で、ドキシサイクリンは、TetRリプレッサーがテトオオペレータに対する親和性を失い、転写4の停止を招く。Tet-Offシステムの特性は、真核細胞6における原核生物調節配列の欠如に対する二次的な多球的効果を回避しながら、真核細胞における特異的mRNA発現の研究に理想的なモデルとなる。通常、二重に安定なテトオフ細胞株(HEK 293、HeLa、およびPC12)は、制御可能な遺伝子発現7、8、9に簡単にアクセスするためのレギュレータおよび応答プラスミドのコピーを統合するためにこのシステムと共に使用される。
培養中の肺胞上皮細胞のいくつかのモデルは、肺胞上皮の細胞および分子生物学を研究するために使用されてきた。何年もの間、研究者は、ヒトまたはげっ歯類の一次細胞10、11だけでなく、ヒトA549またはラットRLE-6TN細胞12、13のような不死化細胞株を広範囲に利用してきた。それらは一般的に増殖が少なく、培養が困難であるが、一次培養における肺胞上皮細胞は、生理学的および病理学的状態における肺胞上皮の機能および機能不全の研究のためのゴールドスタンダードのままである。実際、A549細胞のような不死化細胞株は、初代細胞の複雑な特性および表現型を示さないが、一次培養における肺胞上皮細胞は肺胞上皮の主な特性を再現する一方、特に偏極性および狭いバリア14、15を形成する能力である。残念ながら、これらの細胞は、リポソームを利用するような従来のトランスフェクション技術に対して非常に耐性があり、Tet-Offなどのプロモーター誘導システムの使用は非常に困難です。
mRNAの転写後変調は、転写産物16の遺伝子発現を迅速に調節する最も有効な方法の1つである。mRNA 3’非翻訳領域(3’UTR)は、このメカニズムにおいて重要な役割を果たしている。5’UTRとは異なり、3’UTRの長さと生物の細胞および形態学的複雑性との間には指数関数的な相関関係があることが示されている。この相関は、3’UTRが、mRNA符号化領域と同様に、進化17を通してますます複雑な転写後変調を可能にする自然選択を受けていることを示唆している。3′ UTRには、転写物の安定性と翻訳に影響を与えるタンパク質およびmiRNAに対する結合部位がいくつか含まれています。
本研究では、3’UTRのGOIにおける高度に保存されたドメインの役割を調べて、転写安定性を制御するツールを開発しました。我々は、肺胞上皮生理学18において重要な役割を果たす上皮ナトリウムチャネル、αサブユニット(αENaC)に焦点を当てた。一次培養中の肺胞上皮細胞は、Tet-Offシステムの2つの成分に一時的にトランスフェクトされ、他のプロトコルを有する転写阻害剤の使用と比較して細胞生理および代謝に最小限の影響を与えるシステムを用いてmRNA安定性における3’UTRの役割の研究を可能にした。非内因性エピトープ(V5)を用いて、内因性遺伝子の発現とGOIの発現を区別するクローニング戦略が開発された。応答および調節プラスミドは、ピペットエレクトロポレーション技術を用いて肺胞上皮細胞に移された。続いて、異なる時間間隔でドキシサイクリンを細胞にインキュベートすることにより、転写物の発現を測定した。転写物の半減期を、トランスフェクトされたtTA-Ad mRNA産物を正規化に用いて改変Cq法でRT-qPCRにより評価した。我々のプロトコルを通じて、我々は異なる条件下で転写後の変調を研究し、より詳細に未翻訳領域の関与を定義するための便利な方法を提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
一次培養における肺胞上皮細胞のトランスフェクション率が低いのは、これらの細胞におけるmRNA安定性を評価するTet-Offシステムの使用に対する重大な制限であった。しかし、この制限はピペットエレクトロポレーションによって克服され、25〜30%のトランスフェクション効率を可能にした(図1および図3)26。
?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
フランシス・ミニョーは、ケベック呼吸器保健ネットワークとカナダ保健研究所(CIHR)肺トレーニングプログラム、FRSQの学生シップ、およびエチュード・シュペリエール研究所の学生シップによって提供されたフェローシップによって支えられ、他のポスドクダレス、モントリオール大学。この研究は、臨床研究におけるゴセリン・ラマール議長とカナダ保健研究所[YBMOP-79544]によって支えられた。
Materials
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A9415 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| Bright-LineHemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Chloroform – Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| ClaI | New England Biolabs | R0197S | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast | Leica | – | |
| DNase I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068015 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium | Wisent Bioproducts | 311-425-CL | |
| Ethanol – Molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Excella E25 ConsoleIncubatorShaker | Eppendorf | 1220G76 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES pH 7.3 | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Heracell 240i | ThermoFisher Scientific | 51026420 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | |
| Isopropanol – Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| LB Broth with agar (Lennox) | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10 | Sigma-Aldrich | L9143 | |
| MEM, powder | Gibco | 61100103 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets | ThermoFisher Scientific | 51025413 | |
| Mupid-exU electrophoresis system | Takara Bio | AD140 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Neon Transfection System Starter Pack | Invitrogen | MPK5000S | |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | |
| One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli | Invitrogen | C854003 | |
| pcDNA3 vector | ThermoFisher Scientific | V790-20 | |
| pcDNA3-EGFP plasmid | Addgene | 13031 | |
| PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| pTet-Off Advanced vector | Takara Bio | 631070 | |
| pTRE-Tight vector | Takara Bio | 631059 | |
| Purified alveolar epithelial cells | n.a. | n.a. | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | QIAGEN | 20021 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software | Applied Biosystems | n.a. | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast | Applied Biosystems | 4485697 | |
| Recombinant Rat TNF-alpha Protein | R&D Systems | 510-RT-010 | |
| Septra | Sigma-Aldrich | A2487 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England Biolabs | M0371S | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725270 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | |
| T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Tet System Approved FBS | Takara Bio | 631367 | |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Water, Molecular biology Grade | Wisent Bioproducts | 809-115-EL |
Referências
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