Primer Alveolar Epitel Hücrelerde MRNA Transkriptlerinin Kararlılığının Araştırılması için Etkili Transkripsiyonel Kontrollü Plazmid Ekspresyon Sistemi
Summary
Burada, bir pipet elektroporasyon tekniğiile birleştiğinde indüklenebilir bir ifade sistemi kullanılarak primer alveoler epitel hücrelerinde bir transkript posttranskripsiyonel modülasyonu incelemek için kullanılabilecek bir araç salıyoruz.
Abstract
Posttranskripsiyonel düzenlemenin incelenmesi, belirli bir haberci RNA’nın (mRNA) modülasyonunun ve hücre homeostazları ve metabolizması üzerindeki etkisini anlamak için temel dir. Gerçekten de, transkript ifadesindeki dalgalanmalar çeviri verimliliğini ve nihayetinde bir transkriptin hücresel aktivitesini değiştirebilir. Bu yöntemlerden bazılarıposttranskripsiyonel modülasyonun uygun şekilde incelenmesini engelleyen sınırlamalara sahip olsa da, mRNA’nın yarıömrünü araştırmak için çeşitli deneysel yaklaşımlar geliştirilmiştir. Bir organizatör indüksiyon sistemi sentetik tetrasiklin-düzenlenmiş organizatörü kontrolü altında ilgi genifade edebilir. Bu yöntem, hücre homeostazını rahatsız etmeden herhangi bir deneysel koşul altında belirli bir mRNA’nın yarı-ömür tahminine olanak sağlar. Bu yöntemin en önemli dezavantajlarından biri, konvansiyonel transfeksiyon tekniklerine son derece dirençli izole birincil hücrelerde bu tekniğin kullanımını sınırlayan transfect hücrelerinin gerekliliğidir. Primer kültürdeki alveoler epitel hücreleri alveoler epitelin hücresel ve moleküler biyolojisini incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır. Birincil alveoler hücrelerin benzersiz özellikleri ve fenotip bu hücrelerde ilgi genlerin posttranskripsiyonel modülasyonları çalışma için gerekli olun. Bu nedenle amacımız, primer kültürde alveoler epitel hücrelerine ilgi çeken mRNA’ların posttranskripsiyonel modülasyonlarını araştırmak için yeni bir araç geliştirmekti. Transkripsiyonel kontrollü plazmid ekspresyonu sistemini primer alveoler epitel hücrelerine yerleştirmek için hızlı ve etkili bir geçici transfeksiyon protokolü tasarladık. Bu klonlama stratejisi, yapı etiketlemek için viral bir epitop kullanarak, endojen mRNA’lar bu yapı ifade kolay ayrımcılık sağlar. Değiştirilmiş δδ sayısallaştırma döngüsü (Cq) yöntemi kullanılarak, transkriptin ifadesi yarı ömrünü ölçmek için farklı zaman aralıklarında ölçülebilir. Verilerimiz, primer alveoler epitel hücrelerinde çeşitli patofizyolojik koşullarda posttranskripsiyonel düzenlemenin incelenmesinde bu yeni yaklaşımın etkinliğini göstermektedir.
Introduction
mRNA’ların yarı ömrünü belirlemek için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. MRNA etiketli pulse-chase bozunma tekniği, en az hücresel bozukluk ile mRNA’lar büyük bir havuzun eşzamanlı değerlendirilmesi için izin verir. Ancak, bu yaklaşım tek bir gen transkriptinin yarılanma ömrünün doğrudan tahmin edilmesine izin vermez ve büyüme faktörleri, ROS, alarminler veya inflamasyon1ile uyarılması nı takiben bir mRNA’nın posttransktranskripsiyonel modülasyonunu incelemek için uygulanamaz.
Aktinomisin D ve α-amanitin gibi transkripsiyon inhibitörlerinin kullanımı, zaman içinde mRNA bozunma kinetiğini ölçmek için nispeten basit bir yöntemdir. Önceki teknikler üzerinde bu yaklaşımın bir ana avantajı, (yani, nabız-kovalamaca) doğrudan belirli bir transkript yarı ömrü tahmin etmek ve farklı tedaviler in bozunma kinetik nasıl etkileyebileceğini karşılaştırmak yeteneğine dayanır. Ancak transkripsiyon inhibitörlerinin hücre fizyolojisi üzerindeki önemli zararlı etkisi2. Gerçekten de, bu ilaçlarla tüm hücre transkripsiyonu inhibisyonu, mikroRNA ‘lar (miRNA’lar) gibi mRNA stabilitesinde rol oynayan anahtar elementlerin sentezini ve mRNA bozunması ve stabilitesi için önemli olan RNA bağlayıcı proteinlerin ekspresyonu ve sentezini perturbingin olumsuz yan etkisine sahiptir. Bu ilaçların gen transkripsiyonunun şiddetli pertürbasyonu bu nedenle artefactually transkript lerin bozulma eğrilerini değiştirebilir.
Organizatör indüksiyon sistemi belirli bir mRNA’nın yarı ömrünü ölçmek için üçüncü bir yaklaşımı temsil eder. Bu yöntem, transkripsiyon inhibitörlerini kullanan yöntemlere benzer şekilde belirli bir mRNA’nın bozulmasını ölçer. İki tip indüksiyon sistemi sıklıkla kullanılmaktadır: seruma bağlı c-fos promotörü3 ve Tet-Off indüklenebilir sistem4. C-fos sistemi ile hücre için toksik olabilecek transkripsiyon inhibitörlerinin kullanılmasına gerek yoktur. Ancak, bu yöntem hücre döngüsü senkronizasyonu gerektirir, hangiinterfaz5 sırasında bir transkript gerçek kararlılığının değerlendirilmesi engeller. Buna karşılık, Tet-Off sistemi sentetik tetrasiklin-düzenlenmiş organizatörü kontrolü altında ilgi geninin güçlü ifade sağlar (GOI). Bu sistem işlevsel olması için hücre içine cotransfected gereken iki elementin varlığını gerektirir. İlk plazmid (pTet-Off) düzenleyici protein tTA-Adv ifade, prokaryotik represör TetR oluşan bir hibrid sentetik transkripsiyon faktörü (Escherichia coli itibaren) viral protein HSV VP16 üç transkripsiyon transaktivasyon etki erimiş. GOI sentetik bir promotör kontrolü altında pTRE-Tight plazmid içine klonlanır (PSıkı),sitomegalovirüs minimal dizi oluşan (CMV) promotör tetO operatör dizisinin yedi tekrarları erimiş. PTight geninin transkripsiyonu TetR’in tetO ile etkileşimine bağlıdır. Tetrasiklin veya türevi, doksisiklin varlığında, TetR represörü tetO operatörü için yakınlık kaybeder, transkripsiyon bir kesilmesine yol açan4. Tet-Off sisteminin özellikleri ökaryotik hücrelerde spesifik mRNA ekspresyonunun incelenmesi için ideal bir model oluştururken, ökaryotik hücrede prokaryotik düzenleyici dizilerin yokluğuna sekonder olan potansiyel pleiotropik etkilerden kaçınılmalıdır6. Genellikle, iki kat kararlı Tet-Off hücre hatları (HEK 293, HeLa, ve PC12) kontrol edilebilir gen ekspresyonu7,8,9uygun erişim için regülatör ve yanıt plazmidlerin kopyalarını entegre etmek için bu sistem ile kullanılır .
Alveoler epitelin hücresel ve moleküler biyolojisini incelemek için kültürdeki alveoler epitel hücrelerinin çeşitli modelleri kullanılmıştır. Yıllardır, araştırmacılar yaygın insan veya kemirgenbirincil hücreleri10,11 yanı sıra insan A549 veya sıçan RLE-6TN hücreleri12,13gibi ölümsüzleştirilmiş hücre hatları kullandık. Genellikle daha az proliferatif ve kültür ve transfect daha zor olmasına rağmen, primer kültür alveoler epitel hücreleri fizyolojik ve patolojik koşullarda alveoler epitel fonksiyonu ve disfonksiyonu çalışma için altın standart olmaya devam etmektedir. Gerçekten de, A549 hücreleri gibi ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri birincil hücrelerin karmaşık özelliklerini ve fenotiplerini sergilemezken, birincil kültürdeki alveoler epitel hücreleri alveoler epitelin ana özelliklerini, özellikle de polarize ve sıkı bariyer oluşturma yeteneğini yeniden özetlez14,15. Ne yazık ki, bu hücreler çok zor Tet-Off gibi bir organizatör kaynaklı sistem kullanımı yapma, lipozomkullananlar gibi geleneksel transfeksiyon teknikleri, çok dayanıklıdır.
mRNA’ların posttranskripsiyonel modülasyonu, transkriptin gen ekspresyonunu hızla modüle etmek için en etkili yöntemlerden biridir16. MRNA 3′ çevrilmemiş bölge (3′ UTR) bu mekanizmada önemli bir rol oynar. 5′ UTR’nin aksine, 3′ UTR’nin uzunluğu ile bir organizmanın hücresel ve morfolojik karmaşıklıkları arasında üstel bir ilişki olduğu gösterilmiştir. Bu korelasyon, 3′ UTR, mRNA kodlama bölgeleri gibi, evrim 17 boyunca giderek daha karmaşık posttranskripsiyonel modülasyon için izin doğal seçilim tabi olduğunu göstermektedir17. 3′ UTR, transkriptin stabilitesini ve çevirisini etkileyen proteinler ve miRNA’lar için çeşitli bağlayıcı bölgeler içerir.
Bu çalışmada, transkript kararlılığının kontrolü için bir GOI 3 ‘UTR son derece korunmuş etki alanlarının rolünü araştırmak için bir araç geliştirdi. Alveoler epitel fizyolojisinde önemli bir rol oynayan epitel sodyum kanalı alfa alt ünitesi (αENaC) üzerinde yoğunlaştık18. Primer kültürdeki alveoler epitel hücreleri, diğer protokollerle transkripsiyon inhibitörlerinin kullanımına kıyasla hücre fizyolojisini ve metabolizmasını en az etkileyen bir sistemle 3′ UTR’nin mRNA stabilitesinde rolünün incelenmesine olanak sağlayan Tet-Off sisteminin iki bileşeni ile başarılı bir şekilde transekse edildi. GoI ekspresyonunu endojen genin ekspresyonundan ayırt etmek için endojen bir epitop (V5) kullanarak bir klonlama stratejisi geliştirilmiştir. Yanıt ve düzenleyici plazmidler daha sonra pipet elektroporasyon tekniği kullanılarak alveoler epitel hücrelerine aktarıldı. Daha sonra, transkript infeksiytin ekspresyonu farklı zaman aralıklarında doksisiklin ile hücreleri kuluçka ile ölçüldü. Transkriptin yarılanma ömrü RT-qPCR tarafından normalizasyon için transfected tTA-Ad mRNA ürünü kullanılarak modifiye edilmiş bir Cq yöntemi ile değerlendirildi. Protokolümüz sayesinde, bir transkriptin transkripsiyonel modülasyonunu farklı koşullar altında incelemek ve çevrilmemiş bölgelerin katılımını daha ayrıntılı olarak tanımlamak için uygun bir yol sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Birincil kültürde alveoler epitel hücrelerinin düşük transfeksiyon oranı bu hücrelerde mRNA kararlılığını değerlendirmek için Tet-Off sisteminin kullanımı için ciddi bir sınırlama olmuştur. Ancak bu sınırlama pipet elektroporasyonu ile aşılarak %25-30 transfeksiyon verimi(Şekil 1 ve Şekil 3)26’yaizin verebilmiştir.
Transkript stabilitesinin ölçülmesi, belirli bir mRNA’nın modüla…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Francis Migneault Quebec Solunum Sağlığı Ağı ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) akciğer eğitim programı, FRSQ’dan bir öğrencilik ve Faculté des Études Supérieures et’den bir öğrencilik tarafından sağlanan bir burs tarafından desteklendi. Doktora sonrası, Université de Montréal. Bu çalışma Gosselin-Lamarre Klinik Araştırma Başkanı ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri [YBMOP-79544] tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A9415 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| Bright-LineHemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Chloroform – Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| ClaI | New England Biolabs | R0197S | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast | Leica | – | |
| DNase I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068015 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium | Wisent Bioproducts | 311-425-CL | |
| Ethanol – Molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Excella E25 ConsoleIncubatorShaker | Eppendorf | 1220G76 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES pH 7.3 | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Heracell 240i | ThermoFisher Scientific | 51026420 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | |
| Isopropanol – Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| LB Broth with agar (Lennox) | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10 | Sigma-Aldrich | L9143 | |
| MEM, powder | Gibco | 61100103 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets | ThermoFisher Scientific | 51025413 | |
| Mupid-exU electrophoresis system | Takara Bio | AD140 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Neon Transfection System Starter Pack | Invitrogen | MPK5000S | |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | |
| One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli | Invitrogen | C854003 | |
| pcDNA3 vector | ThermoFisher Scientific | V790-20 | |
| pcDNA3-EGFP plasmid | Addgene | 13031 | |
| PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| pTet-Off Advanced vector | Takara Bio | 631070 | |
| pTRE-Tight vector | Takara Bio | 631059 | |
| Purified alveolar epithelial cells | n.a. | n.a. | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | QIAGEN | 20021 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software | Applied Biosystems | n.a. | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast | Applied Biosystems | 4485697 | |
| Recombinant Rat TNF-alpha Protein | R&D Systems | 510-RT-010 | |
| Septra | Sigma-Aldrich | A2487 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England Biolabs | M0371S | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725270 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | |
| T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Tet System Approved FBS | Takara Bio | 631367 | |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Water, Molecular biology Grade | Wisent Bioproducts | 809-115-EL |
Referências
- Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
- Ljungman, M. The transcription stress response. Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).
- Ross, J. mRNA stability in mammalian cells. Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).
- Harkin, D. P., et al. Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1. Cell. 97 (5), 575-586 (1999).
- Formisano, L., et al. The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway. Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).
- Yin, D. X., Schimke, R. T. BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells. Pesquisa do Câncer. 55 (21), 4922-4928 (1995).
- Johnstone, R. W., et al. Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival. Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).
- Olotu, C., et al. Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).
- Goldmann, T., et al. Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis. Respiratory Research. 19 (1), 138 (2018).
- Huang, C., et al. Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).
- Gao, R., et al. Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway. Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).
- Cooper, J. R., et al. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS One. 11 (10), e0164438 (2016).
- Hirakata, Y., et al. Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).
- Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. Regulatory functions of 3’UTRs. Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).
- Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. Lengthening of 3’UTR increases with morphological complexity in animal evolution. Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).
- Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease. Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).
- Boncoeur, E., et al. Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).
- Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
- Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).
- Ke, S. H., Madison, E. L. Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube ‘megaprimer’ PCR method. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).
- Gossen, M., Bujard, H., Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. . Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine. , (2001).
- Migneault, F., et al. Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3′ Untranslated Region. Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).
- Migneault, F. . Modulation de la stabilité de l’ARNm alphaENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires: détermination du rôle des séquences 3′ non traduites. , (2015).
- Grzesik, B. A., et al. Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).
- Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells. Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).
- Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide. Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31 (2012).
- Hovel, H., Frieling, K. H. The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis. Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).
- Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
