Analyse van zijpopulatie in vaste tumorcellijnen
Summary
Een handige, snelle en kosteneffectieve methode om het aandeel zijpopulatiecellen in solide tumorcellijnen te meten, wordt gepresenteerd.
Abstract
Kankerstamcellen (CSC’s) zijn een belangrijke oorzaak van tumorgroei, metastase en recidief. Isolatie en identificatie van CSC’s zijn van groot belang voor tumoronderzoek. Momenteel worden verschillende technieken gebruikt voor de identificatie en zuivering van CSC’s uit tumorweefsels en tumorcellijnen. Scheiding en analyse van zijpopulatiecellen (SP) zijn twee van de meest gebruikte methoden. De methoden zijn gebaseerd op het vermogen van CSC’s om fluorescerende kleurstoffen snel te verdrijven, zoals Hoechst 33342. De efflux van de kleurstof wordt geassocieerd met de ATP-binding cassette (ABC) transporters en kan worden geremd door ABC transporter remmers. Methoden voor het kleuren van gekweekte tumorcellen met Hoechst 33342 en het analyseren van het aandeel van hun SP-cellen door flowcytometrie worden beschreven. Deze test is handig, snel en kosteneffectief. Gegevens die in deze test worden gegenereerd, kunnen bijdragen aan een beter begrip van het effect van genen of andere extracellulaire en intracellulaire signalen op de stameigenschappen van tumorcellen.
Introduction
Kankerstamcellen (CSC’s) zijn deelverzamelingen van cellen met zelfvernieuwingsvermogen en multipel differentiatiepotentieel, die een vitale rol spelen bij tumorgroei, metastase en recidief1,2. Momenteel zijn CSC’s geïdentificeerd om te bestaan in een verscheidenheid van kwaadaardige tumoren, met inbegrip van long-, hersen-, alvleesklier-, prostaat-, borst- en leverkankers3,4,5,6,7,8,9. Identificatie van CSC’s in deze tumoren is voornamelijk gebaseerd op de aanwezigheid van oppervlaktemarkereiwitten, zoals hoge en/of lage expressie van CD44, CD24, CD133 en Sca-19,10, maar een unieke marker die CSC’s van niet-CSC’s kan onderscheiden, is tot nu toe niet gerapporteerd. Momenteel worden verschillende technieken gebruikt om CSC’s in tumorweefsel of tumorcellijnen te identificeren en te zuiveren. Deze technieken zijn ontworpen op basis van de specifieke eigenschappen van CSC’s. Onder hen, assays en sortering van zijpopulatie (SP) cellen zijn twee van de meest gebruikte methoden.
SP-cellen werden oorspronkelijk ontdekt door Goodell et al.11, toen ze hematopoëtische stamcellen in beenmergcellen van muizen kenmerkten. Toen de beenmergcellen van de muis werden gelabeld met de fluorescerende kleurstof Hoechst 33342, verscheen een kleine groep Hoechst 33342 zwak bevlekte cellen in de tweedimensionale puntplot van een flowcytometrietest. Hoechst 33342 is een DNA-bindende kleurstof en heeft ten minste twee bindingsmodi die leiden tot verschillende spectrale kenmerken. Bij het bekijken van fluorescentie-emissie op twee golflengten tegelijkertijd, kunnen meerdere populaties worden onthuld12. In hun test werd de Hoechst 33342 opgewekt bij 350 nm en werd de fluorescentie gemeten met behulp van het 450/20 nm band-pass (BP) filter en 675 nm edge filter long-pass (EFLP)11. Vergeleken met de hele populatie beenmergcellen werd deze groep cellen verrijkt met hematopoëtische stamcellen genaamd SP-cellen11. SP-cellen kunnen Hoechst 33342 snel verdrijven. De efflux van deze kleurstof is gerelateerd aan ATP-binding cassette (ABC) transporters13, die kunnen worden geremd door sommige middelen zoals Fumitremorgin C14, Verapamil en Reserpine15,16. Daarna werden verschillende verhoudingen SP-cellen gedetecteerd in een verscheidenheid aan weefsels, organen, tumorweefsels en tumorcellijnen17,18,19. Deze SP-cellen hebben veel kenmerken van stamcellen17,19.
Dit manuscript beschrijft Hoechst 33342 etikettering en kleuring van gekweekte tumorcellen en de analyse van SP-cellen door flowcytometrie. Bovendien wordt optimalisatie van de Concentratie Hoechst 33342 en de juiste blokkerselectie voor een specifieke tumorcellijn met behulp van deze aanpak getoond. Ten slotte worden de effecten van stemheidsbevordering of remmingssignalen op het aandeel SP in tumorcellen aangetoond. De experimentele voorbeelden tonen aan dat analyse van SP kan worden gebruikt om de effecten van verschillende signalen te onderzoeken, zoals genexpressie, kleine remmers, activatoren, cytokinen en chemokinen, op tumorstamheid. In vergelijking met andere methoden voor isolatie en zuivering van CSC’s, zoals het sorteren van CD44+/ CD24– populatie, aldehydedehydrogenase (ALDH) analyse en tumorbolvormingstesten, is deze methode gemakkelijker te manipuleren en is het kosteneffectief.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn een aantal belangrijke punten om in gedachten te houden voor de SP-test. De eerste is de selectie van een goede blokker, zoals Verapamil of Reserpine, voor elke cellijn, omdat de “gate” locatie van de SP-cellen wordt bepaald op basis van de positie waarin een groot aantal SP-cellen verdwijnt na de toevoeging van de blocker. Voor de MDA-MB-231 cellijn werkt Reserpine goed. Voor andere cellijnen kunnen verschillende blokkers echter beter werken.
De tweede is de concentratie van Hoechst 3…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de Natural Science Foundation of China 81572599, 81773124 en 81972787; Natural Science Foundation van Tianjin City (China) 19JCYBJC27300; Tianjin People’s Hospital & Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Fundamentele onderzoeksfondsen voor de centrale universiteiten, Nankai University 63191153.
Materials
| 6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
| Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
| Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
| Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
| Hoechst33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
| Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5mL |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
| Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
| SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |
Referências
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
- Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death & Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).
- Bailey, J. M., et al. DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer. Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).
- Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis. British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
- Schulenburg, A., et al. Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application. Journal of Hematology & Oncolcology. 8, 16 (2015).
- Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer. Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Goodell, M. A. Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP). Current Protocols in Cytometry. , 18 (2005).
- Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).
- Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein. Pesquisa do Câncer. 60 (1), 47-50 (2000).
- Takara, K., et al. Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells. Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).
- Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs. Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).
- Challen, G. A., Little, M. H. A side order of stem cells: the SP phenotype. Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).
- Wu, C., Alman, B. A. Side population cells in human cancers. Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).
- Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Pesquisa do Câncer. 65 (14), 6207-6219 (2005).
- Yamada, M., et al. Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer’s disease. Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).
- Marotta, L. L., et al. The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors. Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).
- Zhang, C. H., et al. From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer. Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).
- Tam, W. L., et al. Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells. Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).
- Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype. Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).
- Petriz, J. Flow cytometry of the side population (SP). Current Protocol in Cytometry. , 23 (2013).
- Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential. Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).
- Shen, W., et al. ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness. Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).
- Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2. Nutrients. 11 (3), 624 (2019).
- Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells. Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).
- Ota, M., et al. ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells. Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).
- Wei, H., et al. The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells. Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).
- Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay. PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188 (2016).
- Han, H., et al. An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells. Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).
- Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population. British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).
- Chiba, T., et al. Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties. Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct “side population” of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).
