Analyse der Seitenpopulation in soliden Tumorzelllinien
Summary
Vorgestellt wird eine komfortable, schnelle und kostengünstige Methode zur Messung des Anteils von Seitenpopulationszellen in soliden Tumorzelllinien.
Abstract
Krebsstammzellen (CSCs) sind eine wichtige Ursache für Tumorwachstum, Metastasierung und Rezidiv. Die Isolierung und Identifizierung von CSCs sind für die Tumorforschung von großer Bedeutung. Derzeit werden verschiedene Techniken zur Identifizierung und Reinigung von CSCs aus Tumorgeweben und Tumorzelllinien eingesetzt. Die Trennung und Analyse von Side Population (SP)-Zellen sind zwei der am häufigsten verwendeten Methoden. Die Methoden basieren auf der Fähigkeit von CSCs, fluoreszierende Farbstoffe wie Hoechst 33342 schnell auszustoßen. Der Ausfluss des Farbstoffs ist mit den ATP-bindenden Kassettentransportern (ABC) assoziiert und kann durch ABC-Transporter-Inhibitoren gehemmt werden. Es werden Methoden zur Färbung kultivierter Tumorzellen mit Hoechst 33342 und zur Analyse des Anteils ihrer SP-Zellen mittels Durchflusszytometrie beschrieben. Dieser Assay ist bequem, schnell und kostengünstig. Die in diesem Assay generierten Daten können zu einem besseren Verständnis der Wirkung von Genen oder anderen extrazellulären und intrazellulären Signalen auf die Stammeigenschaften von Tumorzellen beitragen.
Introduction
Krebsstammzellen (CSCs) sind Untergruppen von Zellen mit Selbsterneuerungsfähigkeit und multiplem Differenzierungspotenzial, die eine wichtige Rolle beim Tumorwachstum, der Metastasierung und dem Wiederauftreten spielen1,2. Derzeit wurden CSCs in einer Vielzahl von bösartigen Tumoren identifiziert, einschließlich Lungen-, Gehirn-, Bauchspeicheldrüsen-, Prostata-, Brust- und Leberkrebs3,4,5, 6,7,8,9. Die Identifizierung von CSCs in diesen Tumoren basiert hauptsächlich auf dem Vorhandensein von Oberflächenmarkerproteinen, wie z. B. hoher und / oder niedriger Expression von CD44, CD24, CD133 und Sca-19,10, aber ein einzigartiger Marker, der CSCs von Nicht-CSCs unterscheiden kann, wurde bisher nicht berichtet. Derzeit werden verschiedene Techniken verwendet, um CSCs in Tumorgewebe oder Tumorzelllinien zu identifizieren und zu reinigen. Diese Techniken basieren auf den spezifischen Eigenschaften von CSCs. Unter ihnen sind Assays und Sortierung von Side Population (SP) Zellen zwei der am häufigsten verwendeten Methoden.
SP-Zellen wurden ursprünglich von Goodell et al.11entdeckt, als sie hämatopoetische Stammzellen in Knochenmarkzellen von Mäusen charakterisierten. Als die Knochenmarkzellen der Maus mit dem fluoreszierenden Farbstoff Hoechst 33342 markiert wurden, erschien eine kleine Gruppe von Hoechst 33342 schwach gefärbten Zellen im zweidimensionalen Punktdiagramm eines Durchflusszytometrie-Assays. Hoechst 33342 ist ein DNA-bindender Farbstoff und hat mindestens zwei Bindungsmodi, die zu unterschiedlichen spektralen Eigenschaften führen. Bei gleichzeitiger Betrachtung der Fluoreszenzemission bei zwei Wellenlängen können mehrere Populationen aufgedeckt werden12. In ihrem Assay wurde der Hoechst 33342 bei 350 nm angeregt und die Fluoreszenz mit dem 450/20 nm Bandpassfilter (BP) und dem 675 nm Kantenfilter Long-Pass (EFLP)11gemessen. Im Vergleich zur gesamten Population von Knochenmarkzellen wurde diese Gruppe von Zellen mit hämatopoetischen Stammzellen angereichert, die SP-Zellen genannt werden11. SP-Zellen sind in der Lage, Hoechst 33342 schnell auszustoßen. Der Ausfluss dieses Farbstoffs ist mit ATP-bindenden Kassettentransportern (ABC)13verwandt, die durch einige Mittel wie FumitremorginC14,Verapamil und Reserpin15,16gehemmt werden können. Danach wurden unterschiedliche Anteile von SP-Zellen in einer Vielzahl von Geweben, Organen, Tumorgeweben und Tumorzelllinien17,18,19nachgewiesen. Diese SP-Zellen haben viele Eigenschaften von Stammzellen17,19.
Dieses Manuskript beschreibt die Hoechst 33342-Markierung und Färbung von kultivierten Tumorzellen und die Analyse von SP-Zellen mittels Durchflusszytometrie. Darüber hinaus werden die Optimierung der Hoechst 33342-Konzentration und die richtige Blockerauswahl für eine bestimmte Tumorzelllinie mit diesem Ansatz gezeigt. Abschließend werden die Auswirkungen von Stängelförder- oder Hemmungssignalen auf den Sp-Anteil in Tumorzellen nachgewiesen. Die experimentellen Beispiele zeigen, dass die Analyse von SP verwendet werden kann, um die Auswirkungen verschiedener Signale wie Genexpression, kleine Inhibitoren, Aktivatoren, Zytokine und Chemokine auf die Tumorstammhaftigkeit zu untersuchen. Im Vergleich zu anderen Methoden zur Isolierung und Reinigung von CSCs, wie z. B. Sortierung von CD44+/ CD24– Population, Aldehyddehydrogenase (ALDH) -Analyse und Tumorsphärenbildungsassays, ist diese Methode einfacher zu manipulieren und kostengünstig.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt mehrere wichtige Punkte, die für den SP-Assay zu beachten sind. Die erste ist die Auswahl eines geeigneten Blockers, wie Verapamil oder Reserpine, für jede Zelllinie, da die “Gate” -Position der SP-Zellen nach der Position bestimmt wird, an der eine große Anzahl von SP-Zellen nach der Zugabe des Blockers verschwindet. Für die Zelllinie MDA-MB-231 funktioniert Reserpine gut. Für andere Zelllinien könnten jedoch verschiedene Blocker besser funktionieren.
Die zweite ist die Konzentr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Natural Science Foundation of China 81572599, 81773124 und 81972787 finanziert; Naturwissenschaftliche Stiftung der Stadt Tianjin (China) 19JCYBJC27300; Tianjin People’s Hospital & Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Grundlagenforschungsfonds für die Zentralen Universitäten, Nankai University 63191153.
Materials
| 6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
| Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
| Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
| Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
| Hoechst33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
| Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5mL |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
| Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
| SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |
Referências
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