JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Pesquisa do Câncer

Solid Tümör Hücre Hatlarında Yan Popülasyon analizi

Published: February 23, 2021
doi:
10.3791/60658
, , , ,
1School of Medicine,Nankai University, 2Tianjin Key Laboratory of Tumour Microenvironment and Neurovascular Regulation, 3Collaborative Innovation Center for Biotherapy,Nankai University

Summary

Katı tümör hücre hatlarındaki yan popülasyon hücrelerinin oranını ölçmek için uygun, hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem sunulmuştur.

Abstract

Kanser kök hücreleri (KSS) tümör büyümesi, metastaz ve nüksün önemli bir nedenidir. CSC’lerin izolasyonu ve tanımlanması tümör araştırmaları için büyük önem taşımaktadır. Günümüzde CSC’lerin tümör dokularından ve tümör hücre hatlarından tanımlanması ve saflaştırılması için çeşitli teknikler kullanılmaktadır. Yan popülasyon (SP) hücrelerinin ayrılması ve analizi yaygın olarak kullanılan yöntemlerden ikisidir. Yöntemler, CSC’lerin Hoechst 33342 gibi floresan boyaları hızla dışarı atma yeteneğine dayanır. Boyanın efflux’u ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcıları ile ilişkilidir ve ABC taşıyıcı inhibitörleri tarafından engellenebilir. Hoechst 33342 ile kültürlü tümör hücrelerini boyama ve SP hücrelerinin akış sitometrisi ile oranını analiz etme yöntemleri açıklanmıştır. Bu test kullanışlı, hızlı ve uygun maliyetlidir. Bu testte oluşturulan veriler, genlerin veya diğer hücre dışı ve hücre içi sinyallerin tümör hücrelerinin köklük özellikleri üzerindeki etkisinin daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunabilir.

Introduction

Kanser kök hücreleri (CSC’ ler), tümör büyümesi, metastaz ve nüks1,2’dehayati rol oynayan, kendini yenileme yeteneğine ve çoklu farklılaşma potansiyeline sahip hücrelerin alt kümeleridir. Şu anda, CSC’lerin akciğer, beyin, pankreas, prostat, meme ve karaciğer kanserleri 3, 4 , 5 ,6,7,8,9dahil olmak üzere çeşitli kötü huylu tümörlerde varolduğutanımlanmıştır. Bu tümörlerde CSC’lerin tanımlanması esas olarak CD44, CD24, CD133 ve Sca-19,10 ‘un yüksek ve/veya düşük ekspresyosu gibi yüzey belirteç proteinlerinin varlığına dayanmaktadır, ancak CSC’leri CSC olmayanlardan ayırt edebilecek benzersiz bir belirteç şimdiye kadar bildirilmemiştir. Şu anda tümör dokusunda veya tümör hücre hatlarında CSC’leri tanımlamak ve arındırmak için çeşitli teknikler kullanılmaktadır. Bu teknikler CSC’lerin belirli özelliklerine göre tasarlanmıştır. Bunlar arasında, yan popülasyon (SP) hücrelerinin tahlilleri ve sıraları yaygın olarak kullanılan yöntemlerden ikisidir.

SP hücreleri başlangıçta Goodell ve ark.11, fare kemik iliği hücrelerinde hematopoetik kök hücreleri karakterize ettiklerinde keşfedildi. Fare kemik iliği hücreleri floresan boya Hoechst 33342 ile etiketlendiğinde, bir akış sitometrisi testinin iki boyutlu nokta grafiğinde hoechst 33342 loş lekeli hücrelerin küçük bir grubu ortaya çıktı. Hoechst 33342 DNA bağlayıcı bir boyadır ve farklı spektral özelliklere yol açan en az iki bağlama moduna sahiptir. Floresan emisyonu aynı anda iki dalga boyunda görüntülerken, birden fazla popülasyon ortaya çıkabilir12. Tahlillerinde Hoechst 33342 350 nm’de heyecanlandı ve floresan 450/20 nm bant geçişi (BP) filtresi ve 675 nm kenar filtresi uzun geçiş (EFLP)11kullanılarak ölçüldü. Kemik iliği hücrelerinin tüm popülasyonu ile karşılaştırıldığında, bu hücre grubu SP hücreleri11adı verilen hematopoetik kök hücreler ile zenginleştirilmiştir. SP hücreleri Hoechst 33342’yi hızla dışarı atabilir. Bu boyanın efflux ile ilgilidir ATP bağlayıcı kaset (ABC) transporters13Fumitremorgin C14, Verapamil ve Reserpine 15,16gibi bazı ajanlar tarafından inhibe edilebilir. Bundan sonra, çeşitli dokularda, organlarda, tümör dokularında ve tümör hücre hatlarında farklı oranlarda SP hücreleri tespit edildi17,18,19. Bu SP hücreleri kök hücrelerin birçok özelliğine sahiptir17,19.

Bu makalede Hoechst 33342 kültürlü tümör hücrelerinin etiketlenerek boyanması ve SP hücrelerinin akış sitometrisi ile analizi açıklanmaktadır. Ayrıca Hoechst 33342 konsantrasyonunun optimizasyonu ve bu yaklaşım kullanılarak belirli bir tümör hücre hattı için uygun bloker seçimi gösterilmiştir. Son olarak, saplanma terfisi veya inhibisyon sinyallerinin tümör hücrelerindeki SP oranı üzerindeki etkileri gösterilmiştir. Deneysel örnekler, SP’nin analizinin gen ekspresyatörleri, küçük inhibitörler, aktivatörler, sitokinler ve kemokinler gibi çeşitli sinyallerin tümör saplığı üzerindeki etkilerini araştırmak için kullanılabileceğini göstermektedir. CD44+/CD24– popülasyonun sıralenmesi, aldehit dehidrogenaz (ALDH) analizi ve tümör küre oluşumu tahlilleri gibi CSC’lerin izolasyonu ve saflaştırılması için diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yöntem manipülasyon için daha kolaydır ve uygun maliyetlidir.

Protocol

1. Hücre hazırlığı Hücre sindirimi ve nötralizasyon Tohum tümör hücreleri (MDA-MB-231 hücreleri gibi) 6 kuyu plakasında ve % 5 CO2ile birlikte verilen 37 °C inkübatörde kültüre edilir. Yoğunlukları yaklaşık% 90’a ulaştığında hücreleri hasat edin. Kültür ortamını iyice emiş ve hücreleri 3 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile 2x yıkayın.NOT: Sinyal yolu inhibitörlerinin (örneğin FRA1 inhibitörü) veya aktivatörlerin (örneğin STAT3 aktivatör…

Representative Results

Bu yönteme göre dört deneysel SP analizi yapıldı. İlkinde üç negatif insan meme kanseri hücre hattı olan MDA-MB-231’deki SP hücrelerinin oranını normal şartlarda tespit ettik. Hücre sayımından sonra Hoechst 33342, 1 x 10 6 hücre içeren bir tüpe3 μg/mL’lik son konsantrasyona eklendi. Reserpine ve Hoechst 33342, sırasıyla 40 μM ve 3 μg/mL’lik son konsantrasyonlara başka bir tüpe eklendi. Pi her iki tüpe de eklendi. FSC-A’nın (X ekseni) PI-A’ya (Y ekseni) karşı noktasal grafiği ü?…

Discussion

SP tahlilleri için akılda tutulması gereken birkaç önemli nokta vardır. Birincisi, her hücre hattı için Verapamil veya Reserpine gibi uygun bir engelleyicinin seçilmesidir, çünkü SP hücrelerinin “kapı” konumu, engelleyicinin eklenmesinden sonra çok sayıda SP hücresinin kaybolduğu konuma göre belirlenir. MDA-MB-231 hücre hattı için Reserpine iyi çalışır. Ancak, diğer hücre hatları için farklı engelleyiciler daha iyi çalışabilir.

İkincisi Hoechst 33342 konsant…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Çin doğa bilimleri vakfı tarafından finanse edildi 81572599, 81773124 ve 81972787; Tianjin Şehri Doğa Bilimleri Vakfı (Çin) 19JCYBJC27300; Tianjin Halk Hastanesi & Nankai Üniversitesi İşbirlikçi Araştırma Hibesi 2016rmnk005; Nankai Üniversitesi Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları 63191153.

Materials

6 well cell culture plate CORNING 3516 9.5 cm2 (approx.)
Colivelin MCE HY-P1061A Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro
Fetal bovine serum (FBS) Biological Industries (BIOIND) 04-001-1ACS
Flow cytometer BD Biosciences BD LSRFortessa
Flow cytometer software BD Biosciences FACSDiva
Flow cytometry analysis software BD Biosciences FlowJo
Hoechst33342 Sigma-Aldrich B2261 bisBenzimide H 33342 trihydrochloride
Polystyrene round bottom test tube CORNING 352054 12 x 75 mm, 5mL
Propidium iodide (PI) Sigma-Aldrich P4170 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide
Reserpine Sigma-Aldrich 83580 (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester
SKLB816 Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25200072
Verapamil hydrochloride Sigma-Aldrich V4629 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
  2. Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
  3. Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death & Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).
  4. Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).
  5. Bailey, J. M., et al. DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer. Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).
  6. Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis. British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).
  7. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  8. Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
  9. Schulenburg, A., et al. Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application. Journal of Hematology & Oncolcology. 8, 16 (2015).
  10. Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer. Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).
  11. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  12. Goodell, M. A. Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP). Current Protocols in Cytometry. , 18 (2005).
  13. Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).
  14. Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein. Pesquisa do Câncer. 60 (1), 47-50 (2000).
  15. Takara, K., et al. Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells. Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).
  16. Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs. Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).
  17. Challen, G. A., Little, M. H. A side order of stem cells: the SP phenotype. Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).
  18. Wu, C., Alman, B. A. Side population cells in human cancers. Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).
  19. Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Pesquisa do Câncer. 65 (14), 6207-6219 (2005).
  20. Yamada, M., et al. Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer’s disease. Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).
  21. Marotta, L. L., et al. The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors. Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).
  22. Zhang, C. H., et al. From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer. Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).
  23. Tam, W. L., et al. Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells. Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).
  24. Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype. Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).
  25. Petriz, J. Flow cytometry of the side population (SP). Current Protocol in Cytometry. , 23 (2013).
  26. Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential. Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).
  27. Shen, W., et al. ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness. Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).
  28. Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2. Nutrients. 11 (3), 624 (2019).
  29. Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells. Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).
  30. Ota, M., et al. ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells. Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).
  31. Wei, H., et al. The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells. Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).
  32. Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay. PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188 (2016).
  33. Han, H., et al. An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells. Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).
  34. Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population. British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).
  35. Chiba, T., et al. Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties. Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).
  36. Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct “side population” of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).
  37. Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).

Tags

Keywords: Side PopulationCancer Stem CellsTumor Cell LinesHoechst 33342Flow CytometrySP AnalysisStemness PropertiesCell CultureCell Preparation
check_url/pt/60658?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Dong, X., Wei, Y., Xu, T., Tan, X., Li, N. Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines. J. Vis. Exp. (168), e60658, doi:10.3791/60658 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image