कैल्शियम आयनोफोर का उपयोग करके लाल रक्त कोशिकाओं में एरिप्टोसिस का शामिल होना
Summary
एरिप्तोसिस को शामिल करने के लिए एक प्रोटोकॉल, एरिथ्रोसाइट्स में प्रोग्राम सेल डेथ, कैल्शियम आयनोफोर, आयनोमाइसिन का उपयोग करके प्रदान किया जाता है। झिल्ली बाहरी पत्रक में स्थानीयकरण फॉस्फेटिटिलसेरीन की निगरानी करके सफल एरिप्तोसिस का मूल्यांकन किया जाता है। प्रोटोकॉल की सफलता को प्रभावित करने वाले कारकों की जांच की गई है और इष्टतम शर्तें प्रदान की गई हैं ।
Abstract
एरिपेटोसिस, एरिथ्रोसाइट प्रोग्राम की गई सेल डेथ, कई हेमेटोलॉजिकल बीमारियों में और एरिथ्रोसाइट्स को चोट लगने के दौरान होती है। एरिप्टोटिक कोशिकाओं की एक बानगी कोशिका झिल्ली की रचनात्मक विषमता का नुकसान है, जिससे झिल्ली बाहरी पत्रक में फॉस्फेटिल्डसेरीन का स्थानांतरण होता है। यह प्रक्रिया सीए2 +की बढ़ी हुई इंट्रासेल्युलर एकाग्रता से शुरू होती है, जो हाथापाई को सक्रिय करती है, एक एंजाइम जो झिल्ली पत्रक के बीच फॉस्फोलिपिड के द्विदिशात्मक आंदोलन की सुविधा प्रदान करता है। विभिन्न रोगग्रस्त परिस्थितियों में एरिप्तोसिस के महत्व को देखते हुए, विट्रो मेंएरिप्टोसिस को प्रेरित करने के प्रयास किए गए हैं। इस तरह के प्रयासों ने आम तौर पर कैल्शियम आयनोफोर, आयनोमाइसिन पर भरोसा किया है, ताकि इंट्रासेलर सीए2 + एकाग्रता को बढ़ाया जा सके और एरिप्तोसिस को प्रेरित किया जा सके। हालांकि, आयनमाइसिन का उपयोग करके एरिपेटोसिस को प्रेरित करने की प्रक्रिया के संबंध में साहित्य में कई विसंगतियों की सूचना मिली है। इसके साथ, हम मानव एरिथ्रोसाइट्स में आयनोमाइसिन-प्रेरित एरिपेटोसिस के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं। हम आयनोफोर एकाग्रता, ऊष्मायन समय और ग्लूकोज की कमी सहित प्रक्रिया में महत्वपूर्ण चरणों पर ध्यान केंद्रित करते हैं, और प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग प्रयोगशाला में एरिप्तोसिस को पुन: उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
एरिथ्रोसाइट्स में प्रोग्राम की गई सेल डेथ, जिसे एरिप्टोसिस भी कहा जाता है, कई नैदानिक स्थितियों और हेमेटोलॉजिकल विकारों में आम है। एरिप्टोसिस कोशिका सिकुड़न और कोशिका प्लाज्मा झिल्ली1,2में फॉस्फोलिपिड विषमता के नुकसान से जुड़ा हुआ है। विषमता की हानि के परिणामस्वरूप फॉस्फेटिटिलसेरीन (पीएस) का स्थानांतरण होता है, एक लिपिड सामान्य रूप से आंतरिक पत्रक3,4में सेल बाहरी पत्रक में स्थानीयकृत होता है, जो मैक्रोफेज को फेगोसाइटोज करने और दोषपूर्ण एरिथ्रोसाइट्स5,6,7,8को हटाने का संकेत देता है। एरिथ्रोसाइट्स के सामान्य जीवन काल के अंत में, मैक्रोफेज द्वारा एरिप्टोटिक कोशिकाओं को हटाना परिसंचरण में एरिथ्रोसाइट्स का संतुलन सुनिश्चित करता है। हालांकि, सिकल सेल रोग और थैलीसीमिया9,10,11जैसी रोगग्रस्त स्थितियों में, बढ़ी हुई एरिप्टोसिस के परिणामस्वरूप गंभीर एनीमिया2हो सकता है। हेमेटोलॉजिकल रोगों में इसके महत्व के कारण, इस प्रक्रिया में अंतर्निहित एरिप्तोसिस और आणविक तंत्र को उत्प्रेरण या बाधित करने वाले कारकों की जांच करने में महत्वपूर्ण रुचि है।
स्वस्थ एरिथ्रोसाइट्स की प्लाज्मा झिल्ली असममित है, जिसमें बाहरी और आंतरिक पत्रकों पर अलग-अलग फॉस्फोलिपिड स्थानीयता है। झिल्ली विषमता मुख्य रूप से झिल्ली एंजाइमों की कार्रवाई से विनियमित होती है। अमीनोफोस्फोलिपिड ट्रांसलोकेस इन लिपिड को सेल इनर पेपरट में निर्देशित करके अमीनोफोस्फोलिपिड, पीएस और फॉस्फेटिफाइडलथेनोथेलामामाइन (पीई) के परिवहन की सुविधा प्रदान करता है। दूसरी ओर, फ्लॉपाज़ फॉस्फोलिपिड्स, फॉस्फेटिडिलकोलिन (पीसी) और स्फिंगोमायलिन (एसएम) वाले कोलीन को कोशिका झिल्ली12के बाहरी पत्रक तक ले जाता है। हालांकि, स्वस्थ कोशिकाओं के विपरीत, एरिप्टोटिक एरिथ्रोसाइट्स की झिल्ली तले हुए होती है। यह एक तीसरे एंजाइम, हाथापाई की कार्रवाई के कारण है, जो अमीनोफोस्फोलिपिड13,14,15,16के द्विदिशात्मक परिवहन को सुविधाजनक बनाकर फॉस्फोलिपिड विषमता को बाधित करता है। स्क्रैम्बलएसई सीए2 +के ऊंचा इंट्रासेलुलर स्तर ों द्वारा सक्रिय होता है। इसलिए, कैल्शियम आयनोफोरस, जो कोशिका झिल्ली12में सीए2 + के परिवहन की सुविधा प्रदान करते हैं, एरिप्टोसिस के कुशल प्रेरक हैं।
आयोनोमाइसिन, कैल्शियम आयनोफोर, व्यापक रूप से एरिथ्रोसाइट्स12,17,18,19,20 ,21,22,23,24,25,26में एरिप्टोसिस को प्रेरित करने के लिए उपयोग किया गया है। आयनोमाइसिन में हाइड्रोफिलिक और हाइड्रोफोबिक दोनों समूह हैं, जो सीए2 + आयन को बांधने और कैप्चर करने के लिए आवश्यक हैं, और इसे साइटोसोलिक स्पेस27,28,29तक ले जाते हैं। इससे तले हुए लोगों की सक्रियता और पीएस के बाहरी पत्रक में स्थानांतरण हो ता है, जिसे पीएस12के उच्च आत्मीयता वाले सेलुलर प्रोटीन एनेक्सिन-वी का उपयोग करके आसानी से पता लगाया जा सकता है। यद्यपि आयनोमाइसिन द्वारा एरिप्टोसिस को ट्रिगर करना आमतौर पर सूचित किया जाता है, साहित्य में काफी विधि विसंगति है(तालिका 1)। एरिपेटोसिस से गुजर रहे एरिथ्रोसाइट्स की आबादी आयनोफोर एकाग्रता, आयनोफोर के साथ उपचार का समय, और एक्स्टोसेलुलर वातावरण की चीनी सामग्री (ग्लूकोज की कमी से सन्तर चैनलसक्रिय हो जाती है और साइटोसोलिक स्पेस में सीए2 + के प्रवेश की सुविधा होती है)30,31। हालांकि, साहित्य में इन कारकों में थोड़ी निरंतरता है, जिससे विट्रो मेंएरिप्टोसिस को पुन: उत्पन्न करना मुश्किल हो जाता है।
इस प्रोटोकॉल में, हम मानव एरिथ्रोसाइट्स में एरिप्टोसिस को प्रेरित करने के लिए एक कदम-दर-कदम प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं। सीए2 + एकाग्रता, आयनोफोर एकाग्रता, उपचार समय, और ग्लूकोज-समाप्त बफर में पूर्व-ऊष्मायन सहित सफल एरिप्तोसिस को प्रभावित करने वाले कारकों की जांच की जाती है और इष्टतम मूल्यों की सूचना दी जाती है। यह प्रक्रिया दर्शाती है कि ग्लूकोज-मुक्त बफर में एरिथ्रोसाइट्स का पूर्व-ऊष्मायन ग्लूकोज युक्त बफर की तुलना में एरिप्टोसिस का प्रतिशत काफी बढ़ जाता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग प्रयोगशाला में विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए एरिप्टोटिक एरिथ्रोसाइट्स का उत्पादन करने के लिए किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रक्रिया का लक्ष्य आयनोफोर एकाग्रता, उपचार समय और बाह्य ग्लूकोज एकाग्रता के लिए इष्टतम मूल्य प्रदान करना है, जो एरिप्तोसिस के सफल शामिल ीकरण को सुनिश्चित करने में महत्वपूर्ण कारक हैं। प्रोटोकॉल ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एनआईएच ग्रांट R15ES030140 और एनएसएफ ग्रांट CBET1903568 ने सपोर्ट किया। ओहियो विश्वविद्यालय में रस कॉलेज ऑफ इंजीनियरिंग एंड टेक्नोलॉजी और केमिकल एंड बायोमॉलिक्यूलर इंजीनियरिंग विभाग से वित्तीय सहायता को भी स्वीकार किया जाता है ।
Materials
| 96-well plate | Fisher Scientific | 12-565-331 | |
| Annexin V Alexa Fluor 488 – apoptosis kit | Fisher Scientific | A10788 | Store at 4 °C |
| BD FACSAria II flow cytometer | BD Biosciences | 643177 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Centrifuge | Millipore Sigma | M7157 | Model Eppendorf 5415C |
| Confocal fluorescence microscopy | Zeiss, LSM Tek Thornwood | Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images | |
| Cover glasses circles | Fisher Scientific | 12-545-100 | |
| Disposable round bottom flow cytometry tube | VWR | VWRU47729-566 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301-100ML | |
| DPBS | VWR Life Science | SH30028.02 | |
| Glucose monohydrate | Sigma-Aldrich | Y0001745 | |
| HEPES Buffer (1 M) | Fisher Scientific | 50-751-7290 | Store at 4 °C |
| Ionomycin calcium salt | EMD Milipore Corp. | 407952-1MG | Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C |
| KCl | Fisher Scientific | P330-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 02-681-5 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Plain glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Synergy HFM microplate reader | BioTek | ||
| Whole blood in ACD | Zen-Bio | Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use |
Referências
- Bratosin, D., et al. Programmed Cell Death in Mature Erythrocytes: A Model for Investigating Death Effector Pathways Operating in the Absence of Mitochondria. Cell Death and Differentiation. 8 (12), 1143-1156 (2001).
- Lang, E., Lang, F. Mechanisms and Pathophysiological Significance of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death. Seminars in Cell and Developmental Biology. 39, 35-42 (2015).
- Garnier, M., et al. Erythrocyte Deformability in Diabetes and Erythrocyte Membrane Lipid Composition. Metabolism. 39 (8), 794-798 (1990).
- Verkleij, A. J., et al. The Asymmetric Distribution of Phospholipids in the Human Red Cell Membrane. A Combined Study Using Phospholipases and Freeze-Etch Electron Microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomembranes. 323 (2), 178-193 (1973).
- de Back, D. Z., Kostova, E. B., van Kraaij, M., van den Berg, T. K., van Bruggen, R. Of Macrophages and Red Blood Cells; A Complex Love Story. Frontiers in Physiology. 5, 9 (2014).
- Fadok, V. A., et al. A Receptor for Phosphatidylserine-Specific Clearance of Apoptotic Cells. Nature. 405 (6782), 85-90 (2000).
- Henson, P. M., Bratton, D. L., Fadok, V. A. The Phosphatidylserine Receptor: A Crucial Molecular Switch. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (8), 627-633 (2001).
- Messmer, U. K., Pfeilschifter, J. New Insights into the Mechanism for Clearance of Apoptotic Cells. BioEssays. 22 (10), 878-881 (2000).
- Basu, S., Banerjee, D., Chandra, S., Chakrabarti, A. Eryptosis in Hereditary Spherocytosis and Thalassemia: Role of Glycoconjugates. Glycoconjugate Journal. 27 (9), 717-722 (2010).
- Kuypers, F. A., et al. Detection of Altered Membrane Phospholipid Asymmetry in Subpopulations of Human Red Blood Cells Using Fluorescently Labeled Annexin V. Blood. 87 (3), 1179-1197 (1996).
- Lang, F., Lang, E., Fller, M. Physiology and Pathophysiology of Eryptosis. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 308-314 (2012).
- Wróbel, A., Bobrowska-Hägerstrand, M., Lindqvist, C., Hägerstrand, H. Monitoring of Membrane Phospholipid Scrambling in Human Erythrocytes and K562 Cells with FM1-43 – a Comparison with Annexin V-FITC. Cellular and Molecular Biology Letters. 19 (2), 262-276 (2014).
- Mohandas, N., Gallagher, P. G. Red Cell Membrane: Past, Present, and Future. Blood. 112 (10), 3939-3948 (2008).
- Barber, L. A., Palascak, M. B., Joiner, C. H., Franco, R. S. Aminophospholipid Translocase and Phospholipid Scramblase Activities in Sickle Erythrocyte Subpopulations. British Journal of Haematology. 146 (4), 447-455 (2009).
- Pretorius, E., Du Plooy, J. N., Bester, J. A. A Comprehensive Review on Eryptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 39 (5), 1977-2000 (2016).
- Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-Dependent Phospholipid Scrambling by TMEM16F. Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).
- Bhuyan, A. A. M., Haque, A. A., Sahu, I., Coa, H., Kormann, M. S. D., Lang, F. Inhibition of Suicidal Erythrocyte Death by Volasertib. Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (4), 1472-1486 (2017).
- Chandra, R., Joshi, P. C., Bajpai, V. K., Gupta, C. M. Membrane Phospholipid Organization in Calcium-Loaded Human Erythrocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 902 (2), 253-262 (1987).
- Alzoubi, K., Calabrò, S., Egler, J., Faggio, C., Lang, F. Triggering of Programmed Erythrocyte Death by Alantolactone. Toxins (Basel). 6 (12), 3596-3612 (2014).
- Jacobi, J., et al. Stimulation of Erythrocyte Cell Membrane Scrambling by Mitotane. Cellular Physiology and Biochemistry. 4 (33), 1516-1526 (2014).
- Totino, P. R. R., Daniel-Ribeiro, C. T., Ferreira-da-Cru, M. Refractoriness of Eryptotic Red Blood Cells to Plasmodium Falciparum Infection: A Putative Host Defense Mechanism Limiting Parasitaemia. PLoS One. 6 (10), e26575 (2011).
- Borst, O., et al. Dynamic Adhesion of Eryptotic Erythrocytes to Endothelial Cells via CXCL16/SR-PSOX. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 302 (4), C644-C651 (2011).
- Tagami, T., Yanai, H., Terada, Y., Ozeki, T. Evaluation of Phosphatidylserine-Specific Peptide-Conjugated Liposomes Using a Model System of Malaria-Infected Erythrocytes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 38 (10), 1649-1651 (2015).
- Mahmud, H., et al. Suicidal Erythrocyte Death, Eryptosis, as a Novel Mechanism in Heart Failure-Associated Anaemia. Cardiovascular Research. 98 (1), 37-46 (2013).
- Signoretto, E., Castagna, M., Lang, F. Stimulation of Eryptosis, the Suicidal Erythrocyte Death by Piceatannol. Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (6), 2300-2310 (2016).
- Lange, Y., Ye, J., Steck, T. L. Scrambling of Phospholipids Activates Red Cell Membrane Cholesterol. Bioquímica. 46 (8), 2233-2238 (2007).
- Lang, F., et al. Eryptosis, a Window to Systemic Disease. Cellular Physiology and Biochemistry. 22 (6), 373-380 (2008).
- Gil-Parrado, S., et al. Ionomycin-Activated Calpain Triggers Apoptosis. A Probable Role for Bcl-2 Family Members. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27217-27226 (2002).
- Liu, C. M., Hermann, T. E. Characterization of Ionomycin as a Calcium Ionophore. Journal of Biological Chemistry. 253 (17), 5892-5894 (1978).
- Klarl, B. A., et al. Protein Kinase C Mediates Erythrocyte “Programmed Cell Death” Following Glucose Depletion. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 290 (1), C244-C253 (2006).
- Danilov, Y. N., Cohen, C. M. Wheat Germ Agglutinin but Not Concanavalin A Modulates Protein Kinase C-Mediated Phosphorylation of Red Cell Skeletal Proteins. FEBS Letters. 257 (2), 431-434 (1989).
- Nazemidashtarjandi, S., Farnoud, A. M. Membrane Outer Leaflet Is the Primary Regulator of Membrane Damage Induced by Silica Nanoparticles in Vesicles and Erythrocytes. Environmental Science Nano. 6 (4), 1219-1232 (2019).
- Jaroszeski, M. J., Heller, R. . Flow Cytometry Protocols. , (2003).
- Ghashghaeinia, M., et al. The Impact of Erythrocyte Age on Eryptosis. British Journal of Haematology. 157 (5), 1365 (2012).
- Repsold, L., Joubert, A. M. Eryptosis: An Erythrocyte’s Suicidal Type of Cell Death. Biomed Research International. 2018 (5), 9405617 (2018).
- Tait, J. F., Gibson, D., Fujikawa, K. Phospholipid Binding Properties of Human Placental Anticoagulant Protein-I, a Member of the Lipocortin Family. Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 7944-7949 (1989).
- Andree, H. A. M., et al. Binding of Vascular Anticoagulant α (VACα) to Planar Phospholipid Bilayers. Journal of Biological Chemistry. 265 (9), 4923-4928 (1990).
- Tait, J. F., Gibson, D. F., Smith, C. Measurement of the Affinity and Cooperativity of Annexin V-Membrane Binding under Conditions of Low Membrane Occupancy. Analytical Biochemistry. 329 (1), 112-119 (2004).
- Jiang, P., et al. Eryptosis as an Underlying Mechanism in Systemic Lupus Erythematosus-Related Anemia. Cellular Physiology and Biochemistry. 40 (6), 1391-1400 (2016).
- Chakrabarti, A., Halder, S., Karmakar, S. Erythrocyte and Platelet Proteomics in Hematological Disorders. Proteomics – Clinical Applications. 10 (4), 403-414 (2016).
