Inductie van Eryptosis in rode bloedcellen met behulp van een calcium-Ionophore

Summary

Een protocol voor de inductie van eryptosis, geprogrammeerde celdood in erytrocyten, met behulp van het calcium ionophore, ionomycine, wordt verstrekt. Succesvolle eryptosis wordt geëvalueerd door het monitoren van de lokalisatie fosfatidylserine in de buitenste bijsluiter van het membraan. Factoren die van invloed zijn op het succes van het protocol zijn onderzocht en optimale omstandigheden geboden.

Abstract

Eryptosis, erytrocyten geprogrammeerde celdood, treedt op in een aantal hematologische ziekten en tijdens letsel aan erytrocyten. Een kenmerk van de eryptotische cellen is het verlies van compositorische asymmetrie van het celmembraan, wat leidt tot de translocatie van fosfatidylserine naar de buitenste bijsluiter van het membraan. Dit proces wordt veroorzaakt door verhoogde intracellulaire concentratie van CA^{2 +}, die activeert scramblase, een enzym dat bidirectionele beweging van fosfolipiden tussen membraan folders vergemakkelijkt. Gezien het belang van eryptosis in verschillende zieke omstandigheden, zijn er inspanningen gedaan om de eryptosis in vitrote induceren. Dergelijke inspanningen hebben zich over het algemeen gebaseerd op het calcium-ionophore, ionomycine, om de intracellulaire CA^{2 +} -concentratie te verbeteren en eryptosis te induceren. Echter, veel discrepanties zijn gemeld in de literatuur met betrekking tot de procedure voor het induceren van eryptosis met behulp van ionomycine. Hierin rapporteren we een stap-voor-stap protocol voor ionomycine-geïnduceerde eryptosis in menselijke erytrocyten. We richten ons op belangrijke stappen in de procedure, waaronder de ionofiele concentratie, incubatietijd en glucose depletie, en geven representatief resultaat. Dit protocol kan worden gebruikt voor het reproduceren van eryptosis in het laboratorium.

Introduction

Geprogrammeerde celdood in erytrocyten, ook bekend als eryptosis, is gebruikelijk in vele klinische aandoeningen en hematologische aandoeningen. Eryptosis wordt geassocieerd met celkrimp en het verlies van fosfolipide asymmetrie in de cel plasma membraan^1,2. Verlies van asymmetrie resultaten in de translocatie van fosfatidylserine (PS), een lipide normaal gelokaliseerd in de binnenste bijsluiter^3,4, naar de buitenste bijsluiter van de cel, die signalen naar macrofagen aan fagocytose en verwijderen defecte erytrocyten^5,6,7,8. Aan het einde van de normale levensduur van erytrocyten zorgt het verwijderen van eryptotische cellen door macrofagen voor het evenwicht van erytrocyten in omloop. Echter, in zieke omstandigheden, zoals sikkelcelziekte en thalassemie^9,10,11, verbeterde eryptosis kan resulteren in ernstige anemie². Vanwege het belang in hematologische ziekten, is er belangrijke belangstelling voor het onderzoeken van de factoren inducerende of remmende eryptosis en de moleculaire mechanismen die aan dit proces ten grondslag liggen.

Het plasma membraan van gezonde erytrocyten is asymmetrisch, met verschillende fosfolipiden lokaliseren op de buitenste en binnenste folders. Membraan asymmetrie wordt voornamelijk gereguleerd door de werking van membraan enzymen. Aminopfosfolipide translocase vergemakkelijkt het transport van aminophospholipiden, PS en fosfatidylethanolamine (PE), door deze lipiden naar de binnenste folder van de cel te sturen. Aan de andere kant, floppase vervoert de choline met fosfolipiden, dunlaag (PC) en sphingomyelinase (SM), van de binnenste naar de buitenste bijsluiter van de cel membraan¹². Echter, in tegenstelling tot gezonde cellen, het membraan van eryptotic erytrocyten is vervormd. Dit komt door de werking van een derde enzym, scramblase, dat de fosfolipide asymmetrie verstoort door het bidirectionele transport van aminophospholipiden^13,14,15,16te vergemakkelijken. Scramblase wordt geactiveerd door verhoogde intracellulaire niveaus van CA^{2 +}. Daarom zijn calcium-ionoforen, die het transport van CA^{2 +} over het celmembraan¹²faciliteren, efficiënte inductoren van eryptosis.

Ionomycine, een calcium-ionophore, is op grote schaal gebruikt voor het opwekken van eryptosis in erytrocyten^{12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26}. Ionomycine heeft zowel hydrofiele als hydrofobe groepen, die nodig zijn om ca^{2 +} Ion te binden en te vangen, en deze te transporteren naar de cytosolische ruimte^27,28,29. Dit leidt tot de activering van de scramblase en translocatie van PS naar de buitenste bijsluiter, die gemakkelijk kan worden gedetecteerd met behulp van annexin-V, een cellulair eiwit met een hoge affiniteit voor PS¹². Hoewel het triggeren van eryptosis door ionomycine vaak wordt gerapporteerd, is er een aanzienlijke methode discrepantie in de literatuur (tabel 1). De populatie van erytrocyten die eryptosis ondergaan, hangt af van verschillende factoren zoals ionofiele concentratie, behandelingstijd met ionofoor, en het suikergehalte van extracellulaire omgeving (glucose depletie activeert catie kanalen en vergemakkelijkt de intrede van CA^{2 +} in de cytosolische ruimte)^30,31. Er is echter weinig consistentie in deze factoren in de literatuur, waardoor het moeilijk is om eryptosis reproductief in vitrouit te voeren.

In dit protocol presenteren we een stapsgewijze procedure voor het opwekken van eryptosis in menselijke erytrocyten. Factoren die van invloed zijn op succesvolle eryptosis, waaronder CA^{2 +} concentratie, ionofiele concentratie, behandelingstijd, en pre-incubatie in glucose-verarmd buffer worden onderzocht en optimale waarden worden gerapporteerd. Deze procedure toont aan dat de pre-incubatie van erytrocyten in een glucose vrije buffer het percentage van de eryptosis aanzienlijk verhoogt in vergelijking met de glucose-bevattende buffer. Dit protocol kan in het laboratorium worden gebruikt om eryptotische erytrocyten te produceren voor verschillende toepassingen.

Protocol

Alle menselijke bloedmonsters die in het hieronder beschreven protocol worden gebruikt, werden als niet-geïdentificeerde monsters aangekocht. Voor deze studie waren geen menselijke proefpersonen rechtstreeks betrokken of geworven. De richtsnoeren van de verklaring van Helsinki moeten worden gebruikt wanneer onderzoek betrekking heeft op menselijke proefpersonen. 1. isolatie van erytrocyten uit volbloed Voeg 500 μL volbloed in zuurcitraat dextrose (ACD) (opgeslagen bij 4 °C) toe aa…

Representative Results

Optimalisatie van de ionomycine concentratie Hoewel ionomycine nodig is om eryptosis te induceren, kunnen verhoogde ionomycine concentraties leiden tot hemolyse (d.w.z. Lysis van erytrocyten en afgifte van hemoglobine), die vermeden moet worden. Behandeling van erytrocyten met 1 μM ionomycine in Ringer-oplossing voor 2 uur volstaat om eryptosis te induceren, zoals blijkt uit succesvolle labeling met annexin-V A…

Discussion

Het doel van deze procedure is om optimale waarden te bieden voor ionofiele concentratie, behandelingstijd en extracellulaire glucoseconcentratie, die belangrijke factoren zijn bij het garanderen van een succesvolle inductie van eryptosis. Een cruciale stap in het protocol is de uitputting van extracellulaire glucose, die, ondanks het belang ervan, niet voldoende is benadrukt in de literatuur. Het suikergehalte in normale beltoon oplossing (5 mM) heeft een remmende werking op de eryptosis. Glucose depletie in de extracel…

Materials

96-well plate	Fisher Scientific	12-565-331
Annexin V Alexa Fluor 488 – apoptosis kit	Fisher Scientific	A10788	Store at 4 °C
BD FACSAria II flow cytometer	BD Biosciences	643177
CaCl2	Fisher Scientific	C79-500
Centrifuge	Millipore Sigma	M7157	Model Eppendorf 5415C
Confocal fluorescence microscopy	Zeiss, LSM Tek Thornwood		Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images
Cover glasses circles	Fisher Scientific	12-545-100
Disposable round bottom flow cytometry tube	VWR	VWRU47729-566
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-100ML
DPBS	VWR Life Science	SH30028.02
Glucose monohydrate	Sigma-Aldrich	Y0001745
HEPES Buffer (1 M)	Fisher Scientific	50-751-7290	Store at 4 °C
Ionomycin calcium salt	EMD Milipore Corp.	407952-1MG	Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C
KCl	Fisher Scientific	P330-500
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	02-681-5
NaCl	Fisher Scientific	S271-500
Plain glass microscope slides	Fisher Scientific	12-544-4
Synergy HFM microplate reader	BioTek
Whole blood in ACD	Zen-Bio		Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use