Induction de l'éryptose dans les globules rouges à l'aide d'un ionophore de calcium

Summary

Un protocole pour l’induction de l’éryptose, la mort cellulaire programmée dans les érythrocytes, utilisant l’ionophore de calcium, l’ionomycine, est fourni. L’éryptose réussie est évaluée en surveillant la phosphatidylserine de localisation dans le foliole externe de membrane. Les facteurs qui influent sur le succès du protocole ont été examinés et des conditions optimales ont été fournies.

Abstract

L’éryptose, érythrocyte programmé la mort cellulaire, se produit dans un certain nombre de maladies hématologiques et pendant les dommages aux érythrocytes. Une caractéristique des cellules éryptotiques est la perte de l’asymétrie compositionnelle de la membrane cellulaire, conduisant à la translocation de la phosphatidylserine à la foliole externe de membrane. Ce processus est déclenché par une concentration intracellulaire accrue de Ca^2,qui active la scramblase, une enzyme qui facilite le mouvement bidirectionnel des phospholipides entre les folioles membranaires. Compte tenu de l’importance de l’éryptose dans diverses conditions malades, il ya eu des efforts pour induire l’éryptose in vitro. Ces efforts ont généralement compté sur l’ionophore de calcium, l’ionomycine, pour augmenter la concentration intracellulaire de Ca^{2 et} induire l’éryptosis. Cependant, beaucoup d’écarts ont été rapportés dans la littérature concernant la procédure pour induire l’éryptosis utilisant l’ionomycine. Ici, nous rapportons un protocole étape par étape pour l’éryptosis induit par l’ionomycine dans les érythrocytes humains. Nous nous concentrons sur les étapes importantes dans la procédure, y compris la concentration d’ionophore, le temps d’incubation, et l’épuisement de glucose, et fournissons le résultat représentatif. Ce protocole peut être utilisé pour induire une éryptose reproductible en laboratoire.

Introduction

La mort cellulaire programmée dans les érythrocytes, également connu sous le nom d’éryptosis, est commune dans beaucoup d’conditions cliniques et de désordres hématologiques. L’éryptose est associée au rétrécissement cellulaire et à la perte d’asymétrie phospholipide dans la membrane plasmatique cellulaire^1,2. La perte d’asymétrie entraîne la translocation de la phosphatidylserine (PS), un lipide normalement localisé dans le dépliant intérieur^3,4, à la foliole externe de la cellule, qui signale aux macrophages de phagocytose et d’enlever les érythrocytes défectueux^5,6,7,8. À la fin de la durée de vie normale des érythrocytes, l’ablation des cellules éryptotiques par macrophages assure l’équilibre des érythrocytes en circulation. Cependant, dans les conditions malades, telles que la drépanocytose et la thalassémie^9,10,11, éryptose améliorée peut entraîner une anémie sévère². En raison de son importance dans les maladies hématologiques, il y a un intérêt significatif dans l’examen des facteurs induisant ou inhibant l’éryptosis et les mécanismes moléculaires sous-jacents à ce processus.

La membrane plasmatique des érythrocytes sains est asymétrique, avec différents phospholipides localisés aux folioles extérieures et intérieures. L’asymétrie membranaire est principalement régulée par l’action des enzymes membranaires. La translocase aminophospholipide facilite le transport des aminophospholipides, ps et phosphatidylethanolamine (PE), en dirigeant ces lipides vers le foliole interne de la cellule. D’autre part, le floppase transporte la choline contenant des phospholipides, de la phosphatidylcholine (PC) et de la sphingomyéline (SM), de l’intérieur à la foliole externe de la membrane cellulaire¹². Cependant, contrairement aux cellules saines, la membrane des érythrocytes éryptotiques est brouillée. Cela est dû à l’action d’une troisième enzyme, scramblase, qui perturbe l’asymétrie phospholipide en facilitant le transport bidirectionnel des aminophospholipides^13,14,15,16. Scramblase est activé par des niveaux intracellulaires élevés de Ca². Par conséquent, les ionophores de calcium, qui facilitent le transport de Ca^{2 à} travers la membrane cellulaire^12,sont des inducteurs efficaces de l’éryptose.

Ionomycin, un ionophore de calcium, a été largement utilisé pour induire l’éryptose dans les érythrocytes^{12,17,18,19,20,21,22},^23,24,25,26. Ionomycin a à la fois des groupes hydrophiles et hydrophobes, qui sont nécessaires pour lier et capturer Ca² ion, et le transporter à l’espace cytosolique^27,28,29. Cela conduit à l’activation de la broussase et la translocation de PS à la foliole externe, qui peut être facilement détectée à l’aide de l’annexine-V, une protéine cellulaire avec une forte affinité à PS¹². Bien que l’éryptose de déclenchement par ionomycine soit généralement rapportée, il y a l’écart considérable de méthode dans la littérature (tableau 1). La population d’érythrocytes subissant l’éryptosis dépend de différents facteurs tels que la concentration d’ionophore, le temps de traitement avec l’ionophore, et la teneur en sucre de l’environnement extracellulaire (l’épuisement de glucose active des canaux de cation et facilite l’entrée de Ca^{2 dans} l’espace cytosolique)^30,31. Cependant, il y a peu de cohérence dans ces facteurs dans la littérature, ce qui rend difficile d’effectuer l’éryptose reproductiblement in vitro.

Dans ce protocole, nous présentons une procédure étape par étape pour induire l’éryptosis dans les érythrocytes humains. Les facteurs affectant l’éryptose réussie, y compris la concentration de Ca^{2, la} concentration d’ionophore, le temps de traitement, et la pré-incubation dans le tampon glucose-appauvri sont examinés et des valeurs optimales sont rapportées. Cette procédure démontre que la pré-incubation des érythrocytes dans un tampon sans glucose augmente considérablement le pourcentage d’éryptosis par rapport au tampon contenant du glucose. Ce protocole peut être utilisé en laboratoire pour produire des érythrocytes éryptotiques pour diverses applications.

Protocol

Tous les échantillons de sang humain utilisés dans le protocole décrit ci-dessous ont été achetés comme échantillons dé-identifiés. Aucun sujet humain n’a été directement impliqué ou recruté pour cette étude. Les lignes directrices de la Déclaration d’Helsinki devraient être utilisées lorsque la recherche porte sur des sujets humains. 1. Isolement d’érythrocyte du sang entier Ajouter 500 ll de sang entier dans du dextrose de citrate acide (ACD) (stocké à 4 oC) dan…

Representative Results

Optimisation de la concentration d’ionomycine Tandis que l’ionomycine est exigée pour induire l’éryptosis, les concentrations accrues d’ionomycine peuvent mener à l’hémolyse (c.-à-d. lysis des érythrocytes et à la libération de l’hémoglobine), qui doit être évitée. Le traitement des érythrocytes avec 1 ionomycine m dans la solution Ringer pendant 2 h suffit à induire l’éryptose, comme en témoigne…

Discussion

Le but de cette procédure est de fournir des valeurs optimales pour la concentration d’ionophore, le temps de traitement, et la concentration extracellulaire de glucose, qui sont des facteurs importants en assurant l’induction réussie de l’éryptosis. Une étape critique dans le protocole est l’épuisement du glucose extracellulaire, qui, en dépit de son importance, n’a pas été suffisamment souligné dans la littérature. La teneur en sucre dans la solution Ringer normale (5 mM) a un effet inhibiteur sur l’éryptose…

Materials

96-well plate	Fisher Scientific	12-565-331
Annexin V Alexa Fluor 488 – apoptosis kit	Fisher Scientific	A10788	Store at 4 °C
BD FACSAria II flow cytometer	BD Biosciences	643177
CaCl2	Fisher Scientific	C79-500
Centrifuge	Millipore Sigma	M7157	Model Eppendorf 5415C
Confocal fluorescence microscopy	Zeiss, LSM Tek Thornwood		Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images
Cover glasses circles	Fisher Scientific	12-545-100
Disposable round bottom flow cytometry tube	VWR	VWRU47729-566
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-100ML
DPBS	VWR Life Science	SH30028.02
Glucose monohydrate	Sigma-Aldrich	Y0001745
HEPES Buffer (1 M)	Fisher Scientific	50-751-7290	Store at 4 °C
Ionomycin calcium salt	EMD Milipore Corp.	407952-1MG	Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C
KCl	Fisher Scientific	P330-500
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	02-681-5
NaCl	Fisher Scientific	S271-500
Plain glass microscope slides	Fisher Scientific	12-544-4
Synergy HFM microplate reader	BioTek
Whole blood in ACD	Zen-Bio		Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use