Produksjon av høy titer smittsomme influensa pseudotyped partikler med konvolutt glykoproteiner fra svært patogene H5N1 og avian H7N9 virus
Summary
Denne protokollen beskriver en eksperimentell prosess for å produsere høy-titer smittsomme viral pseudotyped partikler (PP) med konvolutt glykoproteiner fra to influensa A stammer og hvordan du kan bestemme deres infectivity. Denne protokollen er svært tilpasningsdyktig til å utvikle PPS av andre typer innhyllet virus med forskjellige konvolutt glykoproteiner.
Abstract
En og annen direkte overføring av det svært patogene fugleinfluensa A-viruset H5N1 (HPAI H5N1) og H7N9 til mennesker og deres dødelighet er alvorlige folkehelseproblemer og tyder på muligheten for en epidemi. Men vår molekylære forståelse av viruset er elementær, og det er nødvendig å studere de biologiske egenskapene til sin konvolutt proteiner som terapeutiske mål og å utvikle strategier for å kontrollere infeksjonen. Vi utviklet en solid viral pseudotyped partikkel (PP) plattform for å studere fugleinfluensaviruset, inkludert funksjonell analyse av sin hemagglutinin (HA) og neuraminidase (NA) konvolutt glykoproteiner, de reassortment egenskapene til HAs og NAs, reseptorer, tropisms, nøytralisere antistoffer, diagnose, infectivity, i forbindelse med narkotika utvikling og vaksine design. Her beskriver vi en eksperimentell prosedyre for å etablere PPS med konvolutten glykoproteiner (HA, NA) fra to influensa A stammer (HAPI H5N1 og 2013 avian H7N9). Deres generasjon er basert på kapasiteten til enkelte virus, for eksempel murine leukemi virus (MLV), å innlemme konvolutt glykoproteiner inn i en PP. I tillegg har vi også detalj hvordan disse PPS er kvantifisert med RT-qPCR, og infectivity påvisning av Native og ikke-samsvarende virus PPS avhengig av opprinnelsen til har og NAs. Dette systemet er svært fleksibelt og tilpasningsdyktig og kan brukes til å etablere viral PPS med konvolutt glykoproteiner som kan innlemmes i en annen type innhyllet virus. Dermed kan denne viral partikkel plattform brukes til å studere vill virus i mange forsknings undersøkelser.
Introduction
Oppdraget av en viral partikkel er å transportere sine Genova fra en infisert vert celle til en ikke-infisert vert celle og å levere den inn i cytoplasma eller kjernen i en replikering-kompetent form1. Denne prosessen er i utgangspunktet utløst av binding til vert celle reseptorer, etterfulgt av fusjon av virionet og cellulære membraner. For innhyllet virus, som influensa virus, Spike glykoproteiner er ansvarlig for reseptor binding og Fusion1,2. Viral konvolutt glykoproteiner (f. eks pyrogener, antigener), er involvert i mange viktige egenskaper og hendelser, for eksempel virus livssyklus initiering (binding og Fusion), viral patogenesen, immunogenisitet, Host Cell apoptose og mobilnettet tropism, mobilnettet endocytic Pathway, samt interspecies overføring og reassortment1,3,4,5,6,7. Forskning på viral konvolutt glykoproteiner vil hjelpe oss å forstå mange aspekter av viral infeksjon prosessen. Pseudotyped viral partikler (PP), også betegnet pseudovirions eller pseudoparticles, kan genereres gjennom en pseudotyping teknikk8,9,10. Denne teknologien har blitt brukt til å utvikle pseudotyped partikler av mange virus, inkludert hepatittC 11,12, hepatitt B13, flytande stomatitt virus (VSV) 14,15, og influensa virus16,17,18,19. Denne teknologien er basert på gag-Pol protein av lentiviruses eller andre retroviruses.
Pseudotyped viral partikler kan fås ved hjelp av en tre-plasmider system ved å cotransfecting en viral konvolutt glykoprotein uttrykk plasmider, en retroviral emballasje plasmider mangler konvolutten env genet, og en egen reporter plasmider i PP produsent celler. Retrovirus er satt sammen av sin gag protein, og det knopper fra en infisert celle membran som uttrykker viruset konvolutt protein1. Derfor er det mulig å oppnå høy titer influensa PPS bruke retrovirus gag protein å produsere knopper på en mobilnettet membran uttrykker influensa HA og NA. I våre tidligere studier, har/NAs i alle kombinasjoner var funksjonelle og i stand til å utføre sine tilsvarende funksjoner i viral livssyklus16,17,18,20,21. Disse PPS brukes til å undersøke influensa biologiske egenskaper, inkludert hemagglutination, neuraminidase aktivitet, HA-reseptor bindende tropism, og infectivity. Fordi HA og NA er begge viktige overflaten funksjonelle proteiner i viral livssyklus, samsvarer ikke har og NAs avledet fra ulike stammer av influensa kan delvis demonstrere reassortment mellom dem. Her genererer vi åtte typer influensa PPS ved å kombinere to har og to NAs (avledet fra HPAI H5N1 belastning og H7N9 flekken), ved hjelp av en tre-plasmider pseudotyping system. Disse åtte typer PPS inkluderer to innfødte PPS, H5N1pp, H7N9pp; to ikke-samsvarende PPS, (H5 + N9) PP, (H7 + N1) PP; og fire PPS bare harboring en enkelt glykoprotein (HA eller NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. studier på influensa viruset, slik som H5N1 og H7N9, er begrenset av biosafety krav. Alle studier av vill influensa virusstammer bør utføres i et biosafety nivå 3 (BSL-3) laboratorium. Pseudotyped viral partikkel teknologi kan brukes til å pakke en kunstig virionet i en biosafety nivå 2 (BSL-2) innstilling. Derfor PPS representerer et tryggere og nyttig verktøy for å studere influensa viruset prosesser avhengig av sine to store glykoproteiner: hemagglutinin (HA) og neuraminidase (NA).
Denne protokollen beskriver generering av disse PPS med en tre-plasmider cotransfection strategi (leses i figur 1), hvordan å kvantifisere PPS, og infectivity deteksjon. PP-produksjonen omfatter tre typer plasmider (figur 1). Den gag-Pol genet, som koder for retrovirus gag-Pol protein, ble klonet fra en retrovirus emballasje Kit og settes inn i pcDNA 3,1 plasmider og oppkalt PcDNA-gag-pol. Den forbedrede grønne fluorescerende protein (eGFP) genet, som koder Green fluorescerende protein, ble klonet fra pTRE-EGFP vektor, settes inn i pcDNA 3,1 plasmider, og kalte pcDNA-GFP. Under kloning, en emballasje signal (ψ) sekvensen ble lagt til via en primer. HA og NA gener ble klonet i en pVRC plasmider, oppkalt pVRC-HA og pVRC-NA, henholdsvis. Den siste plasmider koder Fusion protein og kan erstattes med andre Fusion protein av interesse. Vår pseudotyping plattform inkluderer to glykoprotein uttrykk plasmider: pVRC-HA og pVRC-NA. Dette kan forenkle forskningen på reassortment mellom ulike virusstammer i en BSL-2 innstilling.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokollen beskriver vi en metode for å produsere influensa virus pseudotyped partikler (PP) i en BSL-2 innstilling. Reporteren plasmider pcDNA-GFP er innlemmet inn i PPS og kan brukes å kvantifisere PPS av FACS inne en infectivity analysen. Vi valgte to typer mottakelige cellelinjer fordi de er mye brukt i influensa forskning. MDCK celler ville gi en god kontroll til variabelen udødeliggjort menneskelige celler som brukes i disse studiene.
Denne protokollen er basert på retroviru…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Zhejiang Provincial Medicine and Health Science and Technology plan (Grant Numbers, 2017KY538), Hangzhou Municipal Medicine og Health Science and Technology plan (Grant Numbers, OO20190070), Hangzhou Medical Science og Teknologi nøkkel Project (Grant Numbers, 2014Z11) og Hangzhou kommunale autonome søknad prosjekt for sosial utvikling og vitenskapelig forskning (Grant Numbers, 20191203B134).
Materials
| Benzonase Nuclease | Millipore | 70664 | Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions |
| Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well) | Corning | 3599 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic Individual alphanumeric codes for well identification |
| Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells) | Costar | 3516 | Individual alphanumerical codes for well identification Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma irradiation |
| Dulbecco's modified essential medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells |
| Fetal bovine serum | Excell | FND500 | fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays |
| Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) | Beckman coulter | cytoflex | |
| Human alveolar adenocarcinoma A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | |
| Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines |
| Inverted fluorescent biological microscope | Olympus | BX51-32P01-FLB3 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX31-12PHP | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets. |
| Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit | NEB | E3006L | Will withstand up to 14,000 RCF RNase-/DNase-free Nonpyrogenic |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | CCL-34 | |
| MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | 33 mm, gamma sterilized |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF | Millipore | SLHV033RS | an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058021 | The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria. |
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Maximum RCF is 12,500 xg Temperature range from -80 °C to 120 °C RNase-/DNase-free Sterile |
| PP Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | 430791 | a stable and highly reactive serine protease |
| Proteinase K | Beyotime | ST532 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic |
| TC-treated Culture Dish (60mm) | Corning | 430166 | Trypsin from bovine pancreas TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein |
| TPCK-trypsin | Sigma | T1426 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
Referências
- Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields Virology (6th). , (2013).
- White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).
- Bright, R. A., et al. Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle. PLoS One. 3 (1), 1501 (2008).
- Yang, J., et al. Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection. PLoS One. 9 (12), 113629 (2014).
- Wyatt, R., Sodroski, J. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens. Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).
- Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death. Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).
- Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis. Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).
- Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses. Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).
- Rubin, H. Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus. Virology. 26, 270-276 (1965).
- Steffen, I., Simmons, G. Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins. Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).
- Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).
- Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).
- Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus. Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).
- Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).
- Zhang, F., et al. Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses. Virus Research. 253, 20-27 (2018).
- Zhang, F., et al. Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2. Journal of Bioterrorism & Biodefense. 2, 104 (2011).
- Wu, J., et al. Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses. PLoS One. 5 (12), 15825 (2010).
- Nefkens, I., et al. Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis. Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).
- Zhang, Y., et al. Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).
- Lin, X., et al. Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).
- McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors. Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).
- Pan, H., et al. Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).
- Szecsi, J., et al. Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses. Virology Journal. 3, 70 (2006).
- Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay. Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).
- Garcia, J. M., Lai, J. C. Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update. Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).
- Haynes, J. R., et al. Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge. Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).
- Schmeisser, F., et al. Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase. Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).
- Liu, Y. V., et al. Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV. Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).
- Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8 (9), 254 (2016).
- Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).
- Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
- Millet, J. K., et al. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. Journal of Visualized Experiments. (145), e59010 (2019).
- Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).
- Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).
- Chen, C. M., et al. Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors. Biologia do Desenvolvimento. 214 (2), 370-384 (1999).
- Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).
- Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions. PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819 (2019).
- Petiot, E., et al. Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17. Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).
