제브라피쉬 정자세포에서 메오틱 염색체 스프레드 의 준비
Summary
핵 표면 퍼짐은 만피증 도중 염색체 사건을 공부하기 위한 필수적인 공구입니다. 여기서 우리는 제브라피쉬 정자세포로부터 의한 1단계 진행 중에 메오성 염색체를 준비하고 시각화하는 방법을 시연한다.
Abstract
Meiosis는 성적인 재생산을 위한 haploid gametes를 만드는 데 필요한 중요한 셀룰러 프로세스입니다. 모형 유기체는 적당한 염색체 분리를 지키는 페어링, 시냅스 및 재조합 사건을 포함하여 meiotic prophase 도중 일어나는 염색체 사건을 이해하는 중요한 역할을 했습니다. 마우스가 이 프로세스의 근본적인 분자 기계장치를 이해하기 위한 중요한 모형이 되는 동안, 이 시스템의 모든 meiotic 사건은 인간 적인 사람 막이오시스와 유사하지 않습니다. 우리는 최근에 인간 정자 발생의 모형으로 zebrafish의 흥미진진한 잠재력을 설명했습니다. 여기에서 우리는 염색체 퍼짐 준비에 있는 meiotic 염색체 그리고 관련있는 단백질을 구상하는 우리의 방법을, 상세히 기술합니다. 이러한 제제는 염색체 구조의 고분해능 분석을 허용하는 장점이 있다. 첫째, 우리는 성인 얼룩말에서 고환을 해부하는 절차를 설명하고, 그 다음에 세포 해리, 용해 및 염색체의 확산을 설명합니다. 다음으로, 우리는 마이오성 색소 단백질의 국소화, 면역 형광 검출 및 핵산 서열, 사이투 혼성화 (FISH)의 형광에 의해 국소화를 검출하는 절차를 설명합니다. 이러한 기술은 제브라피시 시스템에서 메오틱 크로마틴 아키텍처의 세포학적 분석을 위한 유용한 도구 세트를 포함한다. zebrafish 지역 사회에 있는 연구원은 이 기술을 빨리 마스터하고 생식 기능의 그들의 표준 분석에 통합할 수 있어야 합니다.
Introduction
성적인 재생산은 두 개의 haploid gametes의 조합을 통해 진행, 각각 체세포세포의 염색체 보완의 절반을 들고. Meiosis는 DNA 복제의 1 개의 라운드 및 염색체 분리의 2개의 연속적인 라운드를 통해 haploid gametes를 생성하는 전문화한 세포 분열입니다. prophase I에서 상동 염색체 (homologs)는 페어링, 재조합 및 시냅시스를 거쳐야하며, 후자는 횡 필라멘트에 의해 브리지 된 두 개의 상동 축을 포함하는 시냅톤 복합체의 형성을 특징으로하는 Sycp1(그림 1A,B). 이러한 프로세스를 제대로 실행하지 못하면 인간1의유산의 주요 원인인 이수성 게임의 생산으로 이어질 수 있습니다. 페어링, 재조합 및 시냅시스 사이의 조정에 대한 우리의 지식은 효모, C. 예쁜꼬마선충,마우스 및 초파리와같은 광범위한 유기체에 대한 연구에 의해 촉진되었습니다2. 상동 염색체 쌍과 분리의 일반적인 과정은 잘 보존되는 동안, 재결합 및 시냅증에 대한 의존성과 이러한 이벤트의 순서는 다양합니다.
상동 재조합을 개시하는 Meiotic 이중 가닥 휴식 (DSB) 형성은 렙토텐 동안 꽃다발에 클러스터된 텔로미어 근처에서 발생하며 시냅스는3,4직후에 계속됩니다. 이러한 DSB 형성 및 시냅스 개시의 구성은 또한 마우스5,6,7,8에서남성 남성 남성 만기증의 특징이며, 제브라피쉬가 인간 정자 발생을 위한 모델로 작용할 수 있음을 시사한다. 또한 제브라피시 인자해를 연구하는 몇 가지 실용적인 이점이 있습니다. 남성과 여성 모두 성인기 동안 gametogenesis을 겪고, 그들의 생식선쉽게 접근 할 수 있으며, 자손의 수백은 하나의 십자가에서 생성됩니다. 부가적으로, 배아는 투명하고 외부적으로 개발되며, 이는 이수엽 게임테스3,9로인한 배아 발달에서 수차의 조기 발견을 용이하게 한다. 제브라피시를 사용하는 단점은 성숙도(~60일)에 도달하는 속도가 느리며 핵 표면 확산에 필요한 물질의 양은 크기에 따라 ~10-20마리의 성인 동물로부터 수집되어야 한다는 것입니다.
meiotic 염색체 퍼짐 준비는 meiotic 염색체 역학의 중요한 서명이 조사될 수 있기 때문에, 모든 모형 유기체에 걸쳐 염색체 역학을 공부하기 위한 중요한 공구입니다. 제브라피시에서, 메오피시 프로그램 및 핵 조직의 진행의 주요 측면은 핵 표면 스프레드를 조사하여 해부되었으며, 여기서 는 염색체 스프레드로 지칭되며, FISH3,4,9,10,11,12에의한 단백질 및/또는 핵산의 면역형광 검출을 위한 항체와 함께 있다. 실제로, 꽃다발내의 군집된 텔로미어의 편광 국소화는 스프레드 제제에서 보존될 수있다(도 1C). 최근에는 형광 검출 방법 및 초고해상도 현미경 검사법과 함께 제브라피쉬 정자 염색체 스프레드를 사용하여 제브라피쉬 텔로미어 역학, 상동성 염색체 페어링, 이중 가닥 파손 국소화 및 시냅스의 상세한 진행을 해명하여 주요 meiotic 전환에서3. 여기에서 우리는 제브라피쉬 고환의 정자 세포에서 염색체 스프레드를 준비하고 그 후에 염색체 관련 단백질의 반복된 텔로미어 서열 및 면역 형광 검출에 형광 펩티드 핵산 (PNA) 탐사기로 그(것)들을 얼룩하는 방법을 제시합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 제브라피시 고환에서 분리된 정자 세포에서 핵 표면에 있는 텔로미어 및 염색체 관련 단백질의 위치를 탐구하는 방법을 기술합니다. 우리는 이 방법이 고환의 크기에 조정을 가진 그밖 teleost 종에 있는 정액 세포의 분석을 위해 적용될 것이라는 점을 기대합니다.
소수의 항체만이 제브라피쉬 메오틱 단백질로 제기되었지만, 우리는 인간(h) 또는 마우스(m) 단?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 제브라피쉬 meiocytes에서 염색체를 확산하고 염색하는 방법을 최적화하는 데 도움 원고와 응우옌에 대한 의견에 대한 트렌트 뉴먼과 마스다 샤리피 에게 감사드립니다. 이 작품은 NIH R01 GM079115에 의해 지원되었다 S.M.B에 수여.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | Several commercial brands available | ||
| 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Several commercial brands available | ||
| 16% formaldehyde, methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 mL | Several commercial brands available | ||
| 24 x 50 mm glass coverslips | Corning | 2980-245 | |
| 24 x 60 mm glasscoverslips | VWR International | 16004-312 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| Autoclave bag | Several commercial brands available | Used to make plastic coverslips. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605-100 | Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water. |
| Cell Strainer, 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed | Biotium | 203775-500uL | Use at 1:1000 |
| Chicken anti-zfSycp1 | Generated by Burgess lab | N/A | Use at 1:100 |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-500MG | |
| Coplin jar | Several commercial brands available | ||
| DNase I, grade II from bovine pancreas | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT10014CV | |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Two are required for dissecting the testes. |
| Eppendorf Tubes, 5 mL | VWR International | 89429-308 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-hDMC1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8973 | Does not work in our hands |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Use at 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| Humidity chamber | Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| Hybridization Oven | VWR International | 230401V (Model 5420) | |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | Model Classic C25 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Kimwipes | Kimerbly-Clark Professional | 34155 | Used for the humidity chamber |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Microscope | Several commercial brands available | Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient. | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse anti-hamsterSCP3 | Abcam | ab97672 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hMLH1 | BD Biosciences | 550838 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hRPA | Sigma-Alrich | MABE285 | Does not work in our hands |
| Na2HPO4 · 7 H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Photo-Flo 200 solution | Electron Microscopy Sciences | 74257 | |
| Plastic transfer pipettes | Several commercial brands available | ||
| PNA TelC-Alexa647 | PNA Bio Inc | F1013 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| PNA TelC-Cy3 | PNA Bio Inc | F1002 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36970 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36971 | |
| Rabbit anti-hRPA | Bethyl | A300-244A | Use at 1:300 |
| Rabbit anti-hSCP3 | Abcam | ab150292 | Use at 1:200 |
| Rabbit anti-hRad51 | GeneTex | GTX100469 | Use at 1:300 |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm | Fisher Scientific | 50-822-353 | Can also use any pair of small scissors. |
| Sylgard kit | Fisher Scientific | NC9897184 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight. |
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003708 | |
| Trypsin inhibitor from chicken egg white | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. |
| Vannas Spring Scissors – 4 mm (micro scissors) | Fine Science Tools | 15018-10 |
Referências
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