Forberedelse af meiotiske kromosomspreads fra zebrafisk spermatocytter
Summary
Nukleare overflade spreads er et uundværligt redskab til at studere kromosom begivenheder under meiose. Her demonstrerer vi en metode til at forberede og visualisere meiotiske kromosomer under profase I fra zebrafisk spermatocytter.
Abstract
Meiosis er den vigtigste cellulære proces, der kræves for at skabe haploid gameter til seksuel reproduktion. Modelorganismer har været medvirkende til at forstå de kromosomhændelser, der finder sted under meiotiske profase, herunder parrings-, synapsis- og rekombinationshændelser, der sikrer korrekt kromosomadskillelse. Mens musen har været en vigtig model for at forstå de molekylære mekanismer, der ligger til grund for disse processer, er det ikke alle meiotiske hændelser i dette system, der svarer til menneskelig meiose. Vi har for nylig vist zebrafiskens spændende potentiale som en model af human spermatogenese. Her beskriver vi i detaljer vores metoder til at visualisere meiotiske kromosomer og tilhørende proteiner i kromosomspredende præparater. Disse præparater har den fordel, at de tillader høj opløsningsanalyse af kromosomstrukturer. For det første beskriver vi proceduren for dissekere fra voksne zebrafisk, efterfulgt af celledissociation, lysis og spredning af kromosomerne. Dernæst beskriver vi proceduren for påvisning af lokalisering af meiotiske kromosomproteiner ved immunofluorescensdetektion og nukleinsyresekvenser ved fluorescens in situ hybridisering (FISH). Disse teknikker omfatter et nyttigt sæt værktøjer til cytologisk analyse af meiotisk kromatinarkitektur i zebrafisksystemet. Forskere i zebrafisk samfund bør være i stand til hurtigt at mestre disse teknikker og indarbejde dem i deres standard analyser af reproduktiv funktion.
Introduction
Seksuel reproduktion fortsætter gennem kombinationen af to haploid gameter, der hver bærer halvdelen af kromosomkomplementet af en somatiske celle. Meiosis er en specialiseret celledivision, der producerer haploid gameter gennem en runde af DNA replikation og to på hinanden følgende runder af kromosom adskillelse. I profase I skal homologiske kromosomer (homologer) gennemgå parring, rekombination og synapsis, hvoraf sidstnævnte er karakteriseret ved dannelsen af synaptonemal komplekset, der består af to homologakser, der er brooveret af den tværgående glødetråd, Sycp1 (Figur 1A, B). Manglende korrekt udføre disse processer kan føre til produktion af aneuploid gameter, som er en førende årsag til aborter hos mennesker1. Vores viden om koordineringen mellem parring, rekombination og synapsis er blevet lettet af undersøgelser i en bred vifte af organismer, såsom gær, C. elegans, mus, og Drosophila, blandt andre2. Mens den generelle proces med homolog kromosom parring efterfulgt af adskillelse er godt bevaret, dens afhængighed af rekombination og synapsis og rækkefølgen af disse begivenheder varierer.
Meiotisk dobbelt-streng pause (DSB) dannelse, som indleder homologre rekombination, forekommer nær telomeres grupperet i buketten under leptotenog synapsis opstår kort efter3,4. Denne konfiguration af DSB dannelse og synapsis indledning er også et karakteristisk træk ved mandlig meiose hos mennesker, men ikke i mus5,6,7,8, tyder på, at zebrafisk kan tjene som model for menneskelige spermatogenese. Der er også flere praktiske fordele ved at studere zebrafisk meiose. Både mænd og kvinder gennemgår gametogenese gennem hele voksenalderen, deres gonader er let tilgængelige, og hundredvis af afkom genereres fra et enkelt kors. Desuden er embryonerne gennemsigtige og udvikler sig eksternt, hvilket letter tidlig påvisning af afvigelser i embryonal udvikling på grund af aneuploid kønsceller3,9. Ulemper ved at bruge zebrafisk er, at de er langsomme til at nå seksuel modenhed (~ 60 dage), og mængden af materiale, der er nødvendige for nukleare overflade spreads skal indsamles fra ~ 10-20 voksne dyr, afhængigt af deres størrelse.
Meiotiske kromosompræparater er et vigtigt redskab til at studere kromosomdynamik på tværs af alle modelorganismer, da centrale signaturer af meiotisk kromosomdynamik kan undersøges. I zebrafisk, centrale aspekter af udviklingen af det meiotiske program og nukleare organisation er blevet dissekeret gennem sondering nukleare overflade breder sig, benævnt her som kromosom spreads, med antistoffer til immunfluorescens påvisning af proteiner og / eller nukleinsyrer af FISH3,4,9,10,11,12. Faktisk kan den polariserede lokalisering af klyngede telomerer i buketten bevares i spredningen forberedelse (Figur 1C). For nylig har vi brugt zebrafisk spermatocyt kromosom breder sig sammen med fluorescens detektionsmetoder og superopløsning mikroskopi til at belyse den detaljerede progression af zebrafisk telomere dynamik, homolog kromosom parring, dobbelt-streng pause lokalisering, og synapsis på centrale meiotiske overgange3. Her præsenterer vi metoder til at forberede kromosomspreads fra spermatocytter af zebrafisk testiklerne og efterfølgende plette dem med fluorescerende peptid nukleinsyre (PNA) sonder til gentagne telomere sekvenser og immunfluorescens påvisning af kromosom tilknyttede proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi metoder til at sonde placeringen af telomerer og kromosom-associerede proteiner i nuklear overflade breder sig fra spermatocytter isoleret fra zebrafisk testikler. Vi forventer, at disse metoder vil være gældende for analyse af spermatocytter i andre teleostarter med tilpasning til testisstørrelse.
Mens kun et par antistoffer er blevet rejst til zebrafisk meiotiske proteiner, har vi haft succes med at bruge følgende antistoffer rejst til menneskelige (h) eller mus (m) prot…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Trent Newman og Masuda Sharifi for kommentarer til manuskriptet og An Nguyen for at hjælpe med at optimere metoder til spredning og farvning kromosomer fra zebrafisk meiocytter. Dette arbejde blev støttet af NIH R01 GM079115 tildelt S.M.B.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | Several commercial brands available | ||
| 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Several commercial brands available | ||
| 16% formaldehyde, methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 mL | Several commercial brands available | ||
| 24 x 50 mm glass coverslips | Corning | 2980-245 | |
| 24 x 60 mm glasscoverslips | VWR International | 16004-312 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| Autoclave bag | Several commercial brands available | Used to make plastic coverslips. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605-100 | Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water. |
| Cell Strainer, 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed | Biotium | 203775-500uL | Use at 1:1000 |
| Chicken anti-zfSycp1 | Generated by Burgess lab | N/A | Use at 1:100 |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-500MG | |
| Coplin jar | Several commercial brands available | ||
| DNase I, grade II from bovine pancreas | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT10014CV | |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Two are required for dissecting the testes. |
| Eppendorf Tubes, 5 mL | VWR International | 89429-308 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-hDMC1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8973 | Does not work in our hands |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Use at 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| Humidity chamber | Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| Hybridization Oven | VWR International | 230401V (Model 5420) | |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | Model Classic C25 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Kimwipes | Kimerbly-Clark Professional | 34155 | Used for the humidity chamber |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Microscope | Several commercial brands available | Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient. | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse anti-hamsterSCP3 | Abcam | ab97672 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hMLH1 | BD Biosciences | 550838 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hRPA | Sigma-Alrich | MABE285 | Does not work in our hands |
| Na2HPO4 · 7 H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Photo-Flo 200 solution | Electron Microscopy Sciences | 74257 | |
| Plastic transfer pipettes | Several commercial brands available | ||
| PNA TelC-Alexa647 | PNA Bio Inc | F1013 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| PNA TelC-Cy3 | PNA Bio Inc | F1002 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36970 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36971 | |
| Rabbit anti-hRPA | Bethyl | A300-244A | Use at 1:300 |
| Rabbit anti-hSCP3 | Abcam | ab150292 | Use at 1:200 |
| Rabbit anti-hRad51 | GeneTex | GTX100469 | Use at 1:300 |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm | Fisher Scientific | 50-822-353 | Can also use any pair of small scissors. |
| Sylgard kit | Fisher Scientific | NC9897184 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight. |
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003708 | |
| Trypsin inhibitor from chicken egg white | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. |
| Vannas Spring Scissors – 4 mm (micro scissors) | Fine Science Tools | 15018-10 |
Referências
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).
- Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio. PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).
- Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish. Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).
- Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. Temporal progression of recombination in human males. Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).
- Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks. PLoS One. 8, e85075 (2013).
- Pratto, F., et al. Recombination initiation maps of individual human genomes. Science. 346, 1256442 (2014).
- Brown, P. W., et al. Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male. American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).
- Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).
- Saito, K., Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C., Sakai, N. Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants. Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).
- Sansam, C. L., Pezza, R. J. Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination. Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).
- Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females. Genética. 175, 1561-1569 (2007).
- Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes. Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).
- Moens, P. B. Zebrafish: chiasmata and interference. Genome. 49, 205-208 (2006).
- Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies. Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).
- Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene. Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).
