Preparazione delle scime cromosomiche meiotiche da Spermatociti di pesce zebra
Summary
Le creme nucleari sono uno strumento indispensabile per studiare gli eventi cromosomici durante la meiosi. Qui dimostriamo un metodo per preparare e visualizzare cromosomi meiotici durante la profase I dagli spermatociti del pesce zebra.
Abstract
La meiosi è il processo cellulare chiave necessario per creare gameti aploidi per la riproduzione sessuale. Gli organismi modello sono stati determinanti nella comprensione degli eventi cromosomici che si verificano durante la profase meiotica, tra cui l’accoppiamento, la sinapsi e gli eventi di ricombinazione che garantiscono una corretta segregazione cromosomica. Mentre il topo è stato un modello importante per comprendere i meccanismi molecolari alla base di questi processi, non tutti gli eventi meiotici in questo sistema sono analoghi alla meiosi umana. Recentemente abbiamo dimostrato l’entusiasmante potenziale del pesce zebra come modello di spermatogenesi umana. Qui descriviamo, in dettaglio, i nostri metodi per visualizzare i cromosomi meiotici e le proteine associate nei preparati di diffusione cromosomica. Questi preparati hanno il vantaggio di consentire l’analisi ad alta risoluzione delle strutture cromosomiche. In primo luogo, descriviamo la procedura per la sezionamento dei testicoli da pesci zebra adulti, seguita da dissociazione cellulare, lisi e diffusione dei cromosomi. Successivamente, descriviamo la procedura per rilevare la localizzazione delle proteine cromosomiche meiotiche, mediante rilevamento dell’immunofluorescenza e sequenze di acidi nucleici, mediante fluorescenza nell’ibridazione in situ (FISH). Queste tecniche comprendono un utile insieme di strumenti per l’analisi citologica dell’architettura della cromatina meiotica nel sistema del pesce zebra. I ricercatori della comunità dei pesci zebra dovrebbero essere in grado di padroneggiare rapidamente queste tecniche e incorporarle nelle loro analisi standard della funzione riproduttiva.
Introduction
La riproduzione sessuale procede attraverso la combinazione di due gameti aploidi, ognuno dei quali trasporta metà del complemento cromosomico di una cellula somatica. La meiosi è una divisione cellulare specializzata che produce gameti aploidi attraverso un ciclo di replicazione del DNA e due cicli successivi di segregazione cromosomica. Nella profase I, i cromosomi omologhi (omologi) devono subire l’abbinamento, la ricombinazione e la sinapsi, quest’ultima caratterizzata dalla formazione del complesso sinatonemale che comprende due assi omologi colmati dal subverso, Sycp1 (Figura 1A,B). La mancata esecuzione corretta di questi processi può portare alla produzione di gameti aneuploidi, che sono una delle principali cause di aborti spontanei in esseri umani1. La nostra conoscenza del coordinamento tra abbinamento, ricombinazione e sinapsi è stata facilitata da studi in una vasta gamma di organismi, come lievito, C. elegans, topo e Drosophila, tra gli altri2. Mentre il processo generale di accoppiamento cromosomico omologato seguito dalla segregazione è ben conservato, la sua dipendenza dalla ricombinazione e dalla sinapsi e l’ordine di questi eventi varia.
La formazione meiotica di rottura a doppio filamento (DSB), che avvia una ricombinazione omologa, si verifica vicino ai telomeri raggruppati nel bouquet durante il leptotene e la sinapsi segue poco dopo3,4. Questa configurazione della formazione e dell’avvio della sinapsi di DSB è anche una caratteristica della meiosi maschile negli esseri umani ma non nel topo5,6,7,8, suggerendo che il pesce zebra può servire come modello per la spermatogenesi umana. Ci sono anche diversi vantaggi pratici dello studio della meiosi del pesce zebra. Sia i maschi che le femmine subiscono gametogenesi durante l’età adulta, le loro gonadi sono facilmente accessibili e centinaia di prole sono generate da una singola croce. Inoltre, gli embrioni sono trasparenti e si sviluppano esternamente, il che facilita la diagnosi precoce di aberrazioni nello sviluppo embrionale a causa di gameti aneuploidi3,9. Svantaggi dell’uso di pesci zebra sono che sono lenti a raggiungere la maturità sessuale (60 giorni) e la quantità di materiale necessaria per gli spread di superficie nucleare deve essere raccolta da 10-20 dollari animali adulti, a seconda delle loro dimensioni.
I preparati meiotici sono uno strumento vitale per studiare la dinamica cromosomica in tutti gli organismi modello, poiché è possibile sondare le firme chiave della dinamica cromosomica meiotica. Nel pesce zebra, gli aspetti chiave della progressione del programma meiotico e dell’organizzazione nucleare sono stati sezionati attraverso la sonda di diffusione della superficie nucleare, indicati qui come si diffonde cromosomica, con anticorpi per il rilevamento immunofluorescenza di proteine e/o acidi nucleici da FISH3,4,9,10,11,12. Infatti, la localizzazione polarizzata dei telomeri raggruppati nel bouquet può essere preservata nella preparazione della diffusione (Figura 1C). Recentemente, abbiamo usato i cromosomi di spermatociti zebrati insieme a metodi di rilevamento della fluorescenza e microscopia a super-risoluzione per chiarire la progressione dettagliata della dinamica dei telomeri di pesce zebra, l’abbinamento cromologo omologoso, la localizzazione delle rotture a doppio filamento e la sinapsi alle transizioni meiotiche chiave3. Qui presentiamo metodi per preparare le crescite cromosomiche dagli spermatociti dei testicoli del pesce zebra e successivamente le macchiamo con sonde fluorescenti di acido nucleico peptide (PNA) a sequenze di telomeri ripetute e rilevamento di immunofluorescenza delle proteine associate al cromosoma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui descriviamo i metodi per sondare la posizione dei telomeri e delle proteine associate ai cromosomi nella superficie nucleare si diffonde dagli spermatociti isolati dai testicoli dei pesci zebra. Prevediamo che questi metodi saranno applicabili per l’analisi di spermatociti in altre specie teleost con regolazione delle dimensioni dei testicoli.
Mentre solo pochi anticorpi sono stati sollevati per le proteine meiotiche dei pesci zebra, abbiamo avuto successo usando i seguenti anticorpi solle…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Trent Newman e Masuda Sharifi per i commenti sul manoscritto e An Nguyen per aver contribuito a ottimizzare i metodi per diffondere e macchiare i cromosomi dai meiociti del pesce zebra. Questo lavoro è stato supportato da NIH R01 GM079115 assegnato a S.M.B.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | Several commercial brands available | ||
| 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Several commercial brands available | ||
| 16% formaldehyde, methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 mL | Several commercial brands available | ||
| 24 x 50 mm glass coverslips | Corning | 2980-245 | |
| 24 x 60 mm glasscoverslips | VWR International | 16004-312 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| Autoclave bag | Several commercial brands available | Used to make plastic coverslips. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605-100 | Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water. |
| Cell Strainer, 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed | Biotium | 203775-500uL | Use at 1:1000 |
| Chicken anti-zfSycp1 | Generated by Burgess lab | N/A | Use at 1:100 |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-500MG | |
| Coplin jar | Several commercial brands available | ||
| DNase I, grade II from bovine pancreas | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT10014CV | |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Two are required for dissecting the testes. |
| Eppendorf Tubes, 5 mL | VWR International | 89429-308 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-hDMC1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8973 | Does not work in our hands |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Use at 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| Humidity chamber | Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| Hybridization Oven | VWR International | 230401V (Model 5420) | |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | Model Classic C25 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Kimwipes | Kimerbly-Clark Professional | 34155 | Used for the humidity chamber |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Microscope | Several commercial brands available | Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient. | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse anti-hamsterSCP3 | Abcam | ab97672 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hMLH1 | BD Biosciences | 550838 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hRPA | Sigma-Alrich | MABE285 | Does not work in our hands |
| Na2HPO4 · 7 H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Photo-Flo 200 solution | Electron Microscopy Sciences | 74257 | |
| Plastic transfer pipettes | Several commercial brands available | ||
| PNA TelC-Alexa647 | PNA Bio Inc | F1013 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| PNA TelC-Cy3 | PNA Bio Inc | F1002 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36970 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36971 | |
| Rabbit anti-hRPA | Bethyl | A300-244A | Use at 1:300 |
| Rabbit anti-hSCP3 | Abcam | ab150292 | Use at 1:200 |
| Rabbit anti-hRad51 | GeneTex | GTX100469 | Use at 1:300 |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm | Fisher Scientific | 50-822-353 | Can also use any pair of small scissors. |
| Sylgard kit | Fisher Scientific | NC9897184 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight. |
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003708 | |
| Trypsin inhibitor from chicken egg white | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. |
| Vannas Spring Scissors – 4 mm (micro scissors) | Fine Science Tools | 15018-10 |
Referências
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