Zebrabalığı Spermatositlerinden Meiotik Kromozom Spreadlerinin Hazırlanması
Summary
Nükleer yüzey spreadleri, kekozis sırasında kromozom olaylarını incelemek için vazgeçilmez bir araçtır. Burada zebrabalığı spermatositlerinden profaz I sırasında meyotik kromozomları hazırlamak ve görselleştirmek için bir yöntem göstermek.
Abstract
Meyozis, eşeyli üreme için haploid gametler oluşturmak için gerekli olan anahtar hücresel süreçtir. Model organizmalar, meyotik profaz sırasında meydana gelen kromozom olaylarının anlaşılmasında, eşleştirme, sinaps ve uygun kromozom ayrımını sağlayan rekombinasyon olayları da dahil olmak üzere etkili olmuştur. Fare bu süreçlerin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için önemli bir model olmakla birlikte, bu sistemdeki tüm meyotik olaylar insan mayoz bölünmesine benzemektedir. Yakın zamanda insan spermatogenezinin bir modeli olarak zebra balığının heyecan verici potansiyelini gösterdik. Burada, kromozom yayılımı preparatlarında meyotik kromozomları ve ilişkili proteinleri görselleştirme yöntemlerimizi ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu preparatlar kromozom yapılarının yüksek çözünürlüklü analizini sağlar. İlk olarak, testislerin yetişkin zebra balığından diseksiyon prosedürünü, ardından hücre ayrışması, lysis ve kromozomların yayılmasını tanımladık. Daha sonra, meyotik kromozom proteinlerinin lokalizasyonunu, immünororesans tespiti ve nükleik asit dizileri ile situ hibridizasyonda (FISH) floresan ile saptandırma prosedürünü tanımladık. Bu teknikler zebra balığı sisteminde ki meyotik kromatin mimarisinin sitolojik analizi için yararlı bir araç kümesi oluşturmaktadır. Zebra balığı topluluğundaki araştırmacılar bu tekniklerde hızlı bir şekilde ustalaşmalı ve bunları üreme fonksiyonlarının standart analizlerine dahil edebilmelidir.
Introduction
Eşeyli üreme, her biri somatik bir hücrenin kromozomunun yarısını taşıyan iki haploid gametin birleşimi ile devam eder. Meyozis DNA replikasyonu bir tur ve kromozom segregasyonu iki ardışık tur ile haploid gamet üreten özel bir hücre bölünmesidir. Profaz I’de homolog kromozomlar (homologlar) eşleştirme, rekombinasyon ve sinapstan geçmelidir, ikincisi enine filament, Sycp1(Şekil 1A,B)ile köprülenmiş iki homolog eksenden oluşan sinaptonal kompleksin oluşumu ile karakterizedir. Bu süreçlerin düzgün bir şekilde yürütülmemesi, insanlarda düşüklerin önde gelen nedenlerinden biri olan aneuploid gametlerin üretimine yol açabilir1. Eşleştirme arasındaki koordinasyon bilgimiz, rekombinasyon ve sinaps, maya, C. elegans,fare ve Drosophilagibi organizmaların geniş bir yelpazede çalışmalar la kolaylaştırılmıştır , diğerleri arasında2. Homolog kromozom eşleştirmesinin ve segregasyonun genel süreci iyi korunmuş olmakla birlikte, rekombinasyon ve sinapsa olan bağımlılığı ve bu olayların sırası farklılık gösterir.
Homolog rekombinasyon başlatan meyotik çift iplikçikli kopma (DSB) oluşumu, leptoten sırasında buket içinde kümelenmiş telomerlerin yakınında oluşur ve sinaps 3,4’tenkısa bir süresonraortaya çıkar. DSB oluşumu ve sinaps inisiyasyonu bu yapılandırma da insanlarda erkek mayoz bir özelliğidir ama fare5değil,6,7,8, zebra balığı insan spermatogenez için bir model olarak hizmet edebilir düşündüren. Zebra balığı meyozisi çalışmanın çeşitli pratik avantajları da vardır. Hem erkek hem de dişiler yetişkinlik boyunca gametogenez geçirirler, gonadlarına kolayca erişilebilir ler ve yüzlerce yavru tek bir haçtan üretilir. Ayrıca, embriyolar şeffaf ve dıştan geliştirmek, hangi aneuploid gametler nedeniyle embriyonik gelişim sapmalarının erken teşhisikolaylaştırır3,9. Zebra balığı kullanmanın dezavantajları, cinsel olgunluğa ulaşmada yavaş olmalarıdır (~60 gün) ve nükleer yüzey spreadleri için gerekli malzeme miktarı boyutlarına bağlı olarak ~10-20 yetişkin hayvanlardan toplanmalıdır.
Meyotik kromozom yayma preparatları, meyotik kromozom dinamiğinin temel imzaları incelenebildiği için, tüm model organizmalarda kromozom dinamiklerinin incelenmesi için hayati bir araçtır. Zebra balığında, meyotik program ve nükleer organizasyonun ilerlemesinin önemli yönleri, burada kromozom yayılımı olarak adlandırılan nükleer yüzey yayınımlarını delme yoluyla incelenmiştir, proteinlerin immünoresans tespiti için antikorlar ve/veya NÜkleik asitler FISHtarafından3,4,9,10,11,12. Nitekim, buket kümelenmiş telomerlerin polarize lokalizasyonu yayılma hazırlığında korunabilir (Şekil 1C). Son zamanlarda, zebrabalığı spermatosit kromozomu, floresan algılama yöntemleri ve süper çözünürlüklü mikroskopi ile birlikte zebrabalığı telomer dinamiği, homolog kromozom eşleştirme, çift iplikli break lokalizasyonu ve sinaps ilerlü anahtar meyatik geçişlerde ayrıntılı ilerlemesini açıklamak için kullandık3. Burada zebra balığı testislerinin spermatositlerinden kromozom spreadlerini hazırlamak ve daha sonra bunları floresan peptit nükleik asit (PNA) probları ile tekrarlanan telomer dizilerine ve kromozom ilişkili proteinlerin immünfloresans tespitine boyamak için yöntemler sarıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, zebra balığı testislerinden izole edilen spermatositlerden yayılan nükleer yüzey deki telomerlerin ve kromozomla ilişkili proteinlerin yerini araştırma yöntemlerini açıklıyoruz. Bu yöntemlerin diğer teleost türlerindeki spermatositlerin analizinde testislerin büyüklüğüne göre ayarlanabilecek şekilde uygulanacağını düşünüyoruz.
Zebrabalığı meiotik proteinlere sadece birkaç antikor yükseltilmiş olsa da, insan (h) veya fare (m) proteinlerine yükseltilm…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz zebrabalığı meiocytes kromozomlar yaymak ve boyama için yöntemleri optimize etmek için yardımcı olmak için el yazması ve An Nguyen hakkında yorum için Trent Newman ve Masuda Sharifi teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH R01 GM079115 tarafından Desteklenmiştir.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | Several commercial brands available | ||
| 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Several commercial brands available | ||
| 16% formaldehyde, methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 mL | Several commercial brands available | ||
| 24 x 50 mm glass coverslips | Corning | 2980-245 | |
| 24 x 60 mm glasscoverslips | VWR International | 16004-312 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| Autoclave bag | Several commercial brands available | Used to make plastic coverslips. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605-100 | Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water. |
| Cell Strainer, 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed | Biotium | 203775-500uL | Use at 1:1000 |
| Chicken anti-zfSycp1 | Generated by Burgess lab | N/A | Use at 1:100 |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-500MG | |
| Coplin jar | Several commercial brands available | ||
| DNase I, grade II from bovine pancreas | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT10014CV | |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Two are required for dissecting the testes. |
| Eppendorf Tubes, 5 mL | VWR International | 89429-308 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-hDMC1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8973 | Does not work in our hands |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Use at 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| Humidity chamber | Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| Hybridization Oven | VWR International | 230401V (Model 5420) | |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | Model Classic C25 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Kimwipes | Kimerbly-Clark Professional | 34155 | Used for the humidity chamber |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Microscope | Several commercial brands available | Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient. | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse anti-hamsterSCP3 | Abcam | ab97672 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hMLH1 | BD Biosciences | 550838 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hRPA | Sigma-Alrich | MABE285 | Does not work in our hands |
| Na2HPO4 · 7 H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Photo-Flo 200 solution | Electron Microscopy Sciences | 74257 | |
| Plastic transfer pipettes | Several commercial brands available | ||
| PNA TelC-Alexa647 | PNA Bio Inc | F1013 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| PNA TelC-Cy3 | PNA Bio Inc | F1002 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36970 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36971 | |
| Rabbit anti-hRPA | Bethyl | A300-244A | Use at 1:300 |
| Rabbit anti-hSCP3 | Abcam | ab150292 | Use at 1:200 |
| Rabbit anti-hRad51 | GeneTex | GTX100469 | Use at 1:300 |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm | Fisher Scientific | 50-822-353 | Can also use any pair of small scissors. |
| Sylgard kit | Fisher Scientific | NC9897184 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight. |
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003708 | |
| Trypsin inhibitor from chicken egg white | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. |
| Vannas Spring Scissors – 4 mm (micro scissors) | Fine Science Tools | 15018-10 |
Referências
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).
- Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio. PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).
- Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish. Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).
- Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. Temporal progression of recombination in human males. Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).
- Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks. PLoS One. 8, e85075 (2013).
- Pratto, F., et al. Recombination initiation maps of individual human genomes. Science. 346, 1256442 (2014).
- Brown, P. W., et al. Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male. American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).
- Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).
- Saito, K., Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C., Sakai, N. Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants. Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).
- Sansam, C. L., Pezza, R. J. Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination. Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).
- Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females. Genética. 175, 1561-1569 (2007).
- Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes. Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).
- Moens, P. B. Zebrafish: chiasmata and interference. Genome. 49, 205-208 (2006).
- Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies. Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).
- Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene. Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).
