Ex Vivo pressurizado Hipocampal Capilar-Parenchymal Arteriole Preparação para estudo funcional

Resumo

O presente manuscrito detalha como isolar as artérias hipocampais e capilares do cérebro do rato e como pressioná-las para a miografia de pressão, imunofluorescência, bioquímica e estudos moleculares.

Resumo

De alterações comportamentais sutis à demência em estágio avançado, o comprometimento cognitivo vascular geralmente se desenvolve após a isquemia cerebral. Acidente vascular cerebral e parada cardíaca são doenças extremamente sexualmente dimórficas, e ambos induzem isquemia cerebral. No entanto, o progresso na compreensão do comprometimento cognitivo vascular e, em seguida, o desenvolvimento de tratamentos específicos para o sexo, tem sido parcialmente limitado por desafios na investigação da microcirculação cerebral de modelos de camundongos em estudos funcionais. Aqui, apresentamos uma abordagem para examinar a sinalização capilar-a-arteriole em uma preparação de arteriole capilar-parenchymal hipvivo (HiCaPA) do cérebro do rato. Descrevemos como isolar, cannuar e pressurizar a microcirculação para medir o diâmetro arteriolar em resposta à estimulação capilar. Mostramos quais controles funcionais apropriados podem ser usados para validar a integridade de preparação hicapa e exibir resultados típicos, incluindo testar o potássio como um agente de acoplamento neurovascular e o efeito do inibidor recentemente caracterizado da família do canal de potássio retificada kir2, ML133. Além disso, comparamos as respostas nos preparativos obtidos de camundongos machos e fêmeas. Embora esses dados reflitam investigações funcionais, nossa abordagem também pode ser usada em biologia molecular, imunoquímica e estudos de eletrofisiologia.

Introdução

A circulação pial na superfície do cérebro tem sido objeto de muito estudo, em parte por causa de sua acessibilidade experimental. No entanto, a topologia da vasculatura cerebral cria regiões distintas. Em contraste com a robusta rede pial rica em anastomoisés com capacidade substancial para redirecionar o fluxo sanguíneo, as artérias parenchymal intracerebrais (PAs) apresentam fornecimento colateral limitado, cada um deles perfusando um volume discreto de tecido nervoso^1,2. Isso cria um efeito de gargalo sobre o fluxo sanguíneo que, combinado com características fisiológicas únicas^3,

Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade do Colorado, Anschutz Medical Campus e foram realizados de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde.

1. Soluções

1. Use solha-tampão de MOPS para a dissecação e para manter amostras em 4 °C antes de sua utilização. Não gaseie a solução. Prepare MOPS soro fisiológico amortecida com seguinte composição: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH₂PO₄, 1 mM MgSO₄, 2.5 mM CaCl₂, 5 mM glicose, 3 mM MOPS, 0.02 mM EDTA, 2 mM pyruvate, 10 mg/mL bovine serum albumin, pH 7.3 em 4 °C.

Resultados

A pequena condução endotelial (SK) e a condução intermediária (IK) Ca²⁺sensíveis aos canais K⁺ exercem uma influência dilatória sobre o diâmetro das PAs. Aplicação de banho de 1 μM NS309, um agonista sintético do canal IK e SK, causou quase dilatação máxima (Figura 2A,B). No entanto, as células endotélias capilares não possuem canais IK e SK e não hiperpolarizam em resposta ao NS309²⁰. Como result.......

Discussão

A preparação pressurizada hicapa (hipocampal capilar-parenchymal arteriole) descrita no presente manuscrito é uma extensão do nosso procedimento bem estabelecido para isolar, pressurizar e estudar as artérias parenchymal²⁹. Recentemente, relatou que os canais Kir2.1 em células endotélias capilares cerebrais sentido aumenta em [K^+]_o associado com a ativação neural, e gerar um sinal hiperpolarizante ascendente que dilata artérias rio^{acima 20}. Revelar est.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,22µ m Filtros de seringa	CELLTREAT Scientific Products	229751
12-0 Nylon (12cm) Preto	Microcirurgia Instruments, Inc	S12-0 NYLON
Controlador Automático de Temperatura	Instruments	TC-324B
Vidro de Borossilicato Diâmetro Externo: 1,2 mm, Diâmetro Interno: 0,68 mm	Sutter Instruments	B120-69-10
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	A7030
CaCl2 di-hidratado	Sigma-Aldrich	C3881
D-(+)-glicose	Sigma-Aldrich	G5767
Escopo de dissecção	Olympus	SZ11
ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — bomba completa com acionamento e cabeça de bomba MS/CA 4-12	Ismatec	ISM 1090
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
Tesoura Fina - Ferramentas de	Ciência Fina	14063-09
Aquecedor de Água Inline	Warner Instruments	SH-27B
Integra™ Miltex™ Fórceps de Tecido	Fisher Scientific	12-460-117
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379
Sulfato de magnésio heptahidratado	Sigma-Aldrich	M1880
MgCl Anidro	Sigma-Aldrich	M8266
Micromanipulador	Narishige	MN-153
ML 133 cloridrato	Tocris	4549
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
NaCl	Sigma-Aldrich	S9625
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9638
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S8875
NS309	Tocris	3895
Picospritzer III - Sistemas de Dispensação de Microinjeção Intracelular, 2 canais	Parker Hannifin	052-0500-900
Servo Controlador de Pressão com Bomba Peristáltica	de Vida Instrumentação	PS-200
Piruvato de Sódio	Pinça
	Tesoura Cirúrgica Fine Science Tools	11252-20
- Sharp-Blunt	Ferramentas Fine Science	14001-13
Extrator de Micropipeta Vertical	Narishige	PP-83

Warner Sharp Sistemas Super Fina Sigma-Aldrich P3662