Ex Vivo Pressurizzato Ippocampo Capillary-Parenchymal Arteriole Preparazione per lo Studio Funzionale
Summary
Il presente manoscritto descrive come isolare le arteriole e i capillari ippocampali dal cervello del topo e come pressurizzarli per la miografia a pressione, l’immunofluorescenza, la biochimica e gli studi molecolari.
Abstract
Dalle sottili alterazioni comportamentali alla demenza in fase avanzata, il danno vascolare si sviluppa in genere a seguito di ischemia cerebrale. L’ictus e l’arresto cardiaco sono malattie sessualmente dimorfiche, ed entrambi inducono l’ischemia cerebrale. Tuttavia, i progressi nella comprensione del danno vascolare vascolare, e quindi nello sviluppo di trattamenti specifici per il sesso, sono stati in parte limitati dalle sfide nello studio della microcircolazione cerebrale dai modelli murini negli studi funzionali. Qui, presentiamo un approccio per esaminare la segnalazione capillary-to-arteriola in una preparazione capillary-ppillaryle capillary-parenchymic (HiCaPA) ex vivo ippocampale -parenchymal (HiCaPA) dal cervello di topo. Descriviamo come isolare, cannulare e pressurizzare la microcircolazione per misurare il diametro arteriolare in risposta alla stimolazione capillare. Mostriamo quali controlli funzionali appropriati possono essere utilizzati per convalidare l’integrità di preparazione HiCaPA e visualizzare risultati tipici, tra cui il test del potassio come agente di accoppiamento neurovascolare e l’effetto dell’inibitore recentemente caratterizzato della famiglia di canali di potassio rettificante interno Kir2, ML133. Inoltre, confrontiamo le risposte nei preparati vinti da topi maschi e femmine. Mentre questi dati riflettono le indagini funzionali, il nostro approccio può essere utilizzato anche negli studi di biologia molecolare, immunochimica ed elettrofisiologia.
Introduction
La circolazione pial sulla superficie del cervello è stata oggetto di molti studi, in parte a causa della sua accessibilità sperimentale. Tuttavia, la topologia della vascolatura cerebrale crea regioni distinte. In contrasto con la solida rete di pial ricca di anastomosi con notevole capacità di reindirizzare il flusso sanguigno, le arteriole parenchimale intracerebrali (PA) presentano un approvvigionamento collaterale limitato, ognuno dei quali perfonde un volume discreto di tessuto nervoso1,2. Questo crea un effetto di collo di bottiglia sul flusso sanguigno che, combinato con caratteristiche fisiologiche uniche3,4,5,6,7,8, rende arteriole intracerebrali un sito cruciale per la regolazione del flusso sanguigno cerebrale (CBF)9,10. Nonostante le sfide tecniche inerenti all’isolamento e alla cannosazione delle PA, l’ultimo decennio ha visto un crescente interesse per gli studi ex-vivo utilizzando navi pressurizzate11,12,13,14,15,16,17. Uno dei motivi di questo maggiore interesse è il notevole sforzo di ricerca condotto sull’accoppiamento neurovascolare (NVC), il meccanismo che sostiene l’iperemia funzionale del cervello18.
A livello regionale, CBF può aumentare rapidamente a seguito di attivazione neurale locale19. I meccanismi cellulari e le proprietà di segnalazione che controllano la NVC sono incompleti. Tuttavia, abbiamo identificato un ruolo precedentemente imprevisto per i capillari cerebrali durante NVC nel percepire l’attività neurale e tradurla in un segnale elettrico iperpolarizzante per dilatare arteriolea a monte20,21,22. Potenziale di azione23,24 e l’apertura di grande conduttanza Ca2 ,attivato K(BK) canali sui piedi di posta astrociti25,26 aumentare la concentrazione di ioni di potassio interstiziale [K]o, che si traduce in attivazione di forte rettificatore interiore K(Kir) canali nell’endotelio vascolare dei capillari. Questo canale è attivato da Kesterno, ma anche dall’iperpolarizzazione stessa. Diffondendosi attraverso giunzioni gap, la corrente iperpolarizzante poi si rigenera in cellule endoteliali capillari adiacenti fino all’arteriolo, dove provoca il rilassamento del miocito e l’aumento della CBF20,21. Lo studio di questo meccanismo ci ha portato a sviluppare una preparazione capillare-parenchymal arteriola (CaPA) pressurizzata per misurare il diametro arteriolare durante la stimolazione capillare con agenti vasoattivi. La preparazione CaPA è composta da un segmento di arteriole intracerebrale cannulato con una ramificazione capillare intatta a valle. Le estremità capillari sono compresse sul fondo del vetro della camera da una micropipetta, che occia e stabilizza l’intera formazione vascolare20,21.
In precedenza abbiamo fatto innovazioni strumentali da imaging Preparati CaPA dalla corteccia del topo20,21 e arteriole dal ratto amigdala13 e ippocampo16,17. Poiché la vascolatura dell’ippocampa riceve maggiore attenzione a causa della sua suscettibilità alle condizioni patologiche, qui forniamo un metodo passo-passo per la preparazione del CaPA dall’ippocampo del topo (HiCaPA) che può essere utilizzato non solo negli studi funzionali NVC, ma anche nella biologia molecolare, nell’immunochimica e nell’elettrofisiologia.
Protocol
Representative Results
Discussion
La preparazione pressurizzata HiCaPA (ippocampo capillary-parenchymal arteriole) descritta nel presente manoscritto è un’estensione della nostra procedura consolidata per isolare, pressurizzare e studiare arteriole parenchymal29. Recentemente abbiamo riferito che Kir2.1 canali in cervello capillare cellule endoteliali senso aumenta in [K]o associato con l’attivazione neurale, e generare un segnale iperpolarizzante ascendente che dilata arterioles a monte20<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Jules Morin per commenti approfonditi sul manoscritto. Questa ricerca è stata finanziata dai premi dell’organizzazione non-profit CADASIL Together We Have Hope, del Center for Women’s Health and Research e della NHLBI R01HL136636 (FD).
Materials
| 0.22µm Syringe Filters | CELLTREAT Scientific Products | 229751 | |
| 12-0 Nylon (12cm) Black | Microsurgery Instruments, Inc | S12-0 NYLON | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Dissection Scope | Olympus | SZ11 | |
| ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head | Ismatec | ISM 1090 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Inline Water Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| Integra™ Miltex™Tissue Forceps | Fisher Scientific | 12-460-117 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| ML 133 hydrochloride | Tocris | 4549 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NS309 | Tocris | 3895 | |
| Picospritzer III – Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel | Parker Hannifin | 052-0500-900 | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P3662 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Vertical Micropipette Puller | Narishige | PP-83 |
Referências
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