Ex Vivo pressurizado Hipocampal Capilar-Parenchymal Arteriole Preparação para estudo funcional
Summary
O presente manuscrito detalha como isolar as artérias hipocampais e capilares do cérebro do rato e como pressioná-las para a miografia de pressão, imunofluorescência, bioquímica e estudos moleculares.
Abstract
De alterações comportamentais sutis à demência em estágio avançado, o comprometimento cognitivo vascular geralmente se desenvolve após a isquemia cerebral. Acidente vascular cerebral e parada cardíaca são doenças extremamente sexualmente dimórficas, e ambos induzem isquemia cerebral. No entanto, o progresso na compreensão do comprometimento cognitivo vascular e, em seguida, o desenvolvimento de tratamentos específicos para o sexo, tem sido parcialmente limitado por desafios na investigação da microcirculação cerebral de modelos de camundongos em estudos funcionais. Aqui, apresentamos uma abordagem para examinar a sinalização capilar-a-arteriole em uma preparação de arteriole capilar-parenchymal hipvivo (HiCaPA) do cérebro do rato. Descrevemos como isolar, cannuar e pressurizar a microcirculação para medir o diâmetro arteriolar em resposta à estimulação capilar. Mostramos quais controles funcionais apropriados podem ser usados para validar a integridade de preparação hicapa e exibir resultados típicos, incluindo testar o potássio como um agente de acoplamento neurovascular e o efeito do inibidor recentemente caracterizado da família do canal de potássio retificada kir2, ML133. Além disso, comparamos as respostas nos preparativos obtidos de camundongos machos e fêmeas. Embora esses dados reflitam investigações funcionais, nossa abordagem também pode ser usada em biologia molecular, imunoquímica e estudos de eletrofisiologia.
Introduction
A circulação pial na superfície do cérebro tem sido objeto de muito estudo, em parte por causa de sua acessibilidade experimental. No entanto, a topologia da vasculatura cerebral cria regiões distintas. Em contraste com a robusta rede pial rica em anastomoisés com capacidade substancial para redirecionar o fluxo sanguíneo, as artérias parenchymal intracerebrais (PAs) apresentam fornecimento colateral limitado, cada um deles perfusando um volume discreto de tecido nervoso1,2. Isso cria um efeito de gargalo sobre o fluxo sanguíneo que, combinado com características fisiológicas únicas3,4,5,6,7,8, faz das artérias intracerebrais um local crucial para o fluxo sanguíneo cerebral (CBF) regulamento9,10. Apesar dos desafios técnicos inerentes ao isolamento e à cannulação das As, a última década tem visto um aumento do interesse em estudos funcionais ex vivo usando embarcações pressurizadas11,12,14,15,16, 17. Uma das razões para esse aumento do interesse é o considerável esforço de pesquisa realizado sobre o acoplamento neurovascular (NVC), o mecanismo que sustenta a hiperemia funcional cerebral18.
Regionalmente, a CBF pode aumentar rapidamente após a ativação neural local19. Os mecanismos celulares e as propriedades de sinalização que controlam o NVC são incompletamente compreendidos. No entanto, identificamos um papel previamente inesperado para os capilares cerebrais durante o NVC na detecção de atividade neural e traduzi-lo em um sinal elétrico hiperpolarizante para dilatar artérias a montante20,21,22. Os potenciais de ação23,24 e a abertura dos canais K+ (BK) ativados por grande conduta Ca2+(BK) nos pés arrumados ascíticos25,26 aumentam a concentração interstitial de íons de potássio [K+]o, o que resulta na ativação de canais retrógrados fortes K+ (Kir) no endotelium vascular dos capilares. Este canal é ativado por Kexterno + mas também pela própria hiperpolarização. Espalhando-se através de junções gap, a corrente hiperpolarizadora, em seguida, regenera em células endotélias capilares adjacentes até a arteriole, onde causa relaxamento miócito e aumento cbf20,21. O estudo deste mecanismo nos levou a desenvolver uma preparação pressurizada de arteriole capilar-parenchymal (CaPA) para medir o diâmetro arteriolar durante a estimulação capilar com agentes vasoativos. A preparação do CaPA é composta por um segmento de arteriole intracerebral cannulado com uma ramificação capilar intacta a jusante. As extremidades capilares são comprimidas contra o fundo de vidro de câmara por uma micropipette, o que oclude e estabiliza toda a formação vascular20,21.
Anteriormente fizemos inovações instrumentais por imagem capa preparações do córtex do rato20,21 e arterioles da amígdala de rato13 e hipocampo16,17. Como a vasculatura hipocampal recebe mais atenção devido à sua suscetibilidade a condições patológicas, aqui fornecemos um método passo a passo para a preparação da CaPA do hipocampo do camundongo (HiCaPA) que não só pode ser usado em estudos funcionais de NVC, mas também em biologia molecular, imunoquímica e eletrofisiologia.
Protocol
Representative Results
Discussion
A preparação pressurizada hicapa (hipocampal capilar-parenchymal arteriole) descrita no presente manuscrito é uma extensão do nosso procedimento bem estabelecido para isolar, pressurizar e estudar as artérias parenchymal29. Recentemente, relatou que os canais Kir2.1 em células endotélias capilares cerebrais sentido aumenta em [K+]o associado com a ativação neural, e gerar um sinal hiperpolarizante ascendente que dilata artérias rioacima 20. R…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Jules Morin por comentários perspicazes sobre o manuscrito. Esta pesquisa foi financiada por prêmios da organização sem fins lucrativos CADASIL Together We Have Hope, do Center for Women’s Health and Research e do NHLBI R01HL136636 (FD).
Materials
| 0.22µm Syringe Filters | CELLTREAT Scientific Products | 229751 | |
| 12-0 Nylon (12cm) Black | Microsurgery Instruments, Inc | S12-0 NYLON | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Dissection Scope | Olympus | SZ11 | |
| ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head | Ismatec | ISM 1090 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Inline Water Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| Integra™ Miltex™Tissue Forceps | Fisher Scientific | 12-460-117 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| ML 133 hydrochloride | Tocris | 4549 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NS309 | Tocris | 3895 | |
| Picospritzer III – Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel | Parker Hannifin | 052-0500-900 | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P3662 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Vertical Micropipette Puller | Narishige | PP-83 |
Referências
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).
- Shih, A. Y., et al. Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
- Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
- De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
- Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).
- Koide, M., et al. The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 25 (1), (2018).
- Girouard, H., et al. Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).
- Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).
- Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).
- Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).
- Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).
- Johnson, A. C., Cipolla, M. J. Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).
- Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. , (2019).
- Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
- Roy, C. S., Sherrington, C. S. On the Regulation of the Blood-supply of the Brain. The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).
- Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
- Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).
- Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells. eLife. 7, 351 (2018).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
- Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion. The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).
- Filosa, J. A., et al. Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain. Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).
- Attwell, D., et al. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
- Coyle, P. Vascular patterns of the rat hippocampal formation. Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).
- Wang, H. R., et al. Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133. ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).
- Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles. Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).
- Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).
- Montagne, A., et al. Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus. Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).
- Zhang, X., et al. Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).
- Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).
