JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociência

Fonksiyonel Çalışma için Ex Vivo Basınçlı Hipokampal Kapiller-Parenkimal Arteriyol Hazırlığı

Published: December 18, 2019
doi:
10.3791/60676
, ,
1Department of Anesthesiology,University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Neurological Sciences,University of Vermont Larner College of Medicine, 3Department of Pharmacology,University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

Mevcut el yazması, hipokampal arteriyol ve kılcal damarları fare beyninden nasıl izole edilebildiğini ve basınç miyografisi, immünoresans, biyokimya ve moleküler çalışmalar için nasıl basınçlandırılabildiğini ayrıntılarıyla anlatmaktadır.

Abstract

İnce davranışsal değişikliklerden geç evre demansa kadar, vasküler kognitif bozukluk genellikle serebral iskemi sonrasında gelişir. İnme ve kardiyak arrest son derece cinsel dimorfik hastalıklardır, ve her ikisi de serebral iskemi neden. Ancak, vasküler bilişsel bozukluğu anlamada ilerleme, ve daha sonra cinsiyete özgü tedaviler geliştirme, kısmen fonksiyonel çalışmalarda fare modellerinden beyin mikrosirkülasyon soruşturma zorlukları ile sınırlı olmuştur. Burada, fare beyninden ex vivo hipokampal kapiller-parenkimal arteriyol (HiCaPA) preparatında kapiller-arteriyol sinyalini incelemek için bir yaklaşım salıyoruz. Kapiller stimülasyona yanıt olarak arterioler çapı ölçmek için mikrosirkülasyonu nasıl izole edebileceğimizi, kanülasyonu nasıl bastırabileceğimizi ve basınçlendirebileceğimizi anlatıyoruz. Biz uygun fonksiyonel kontroller HiCaPA hazırlık bütünlüğünü doğrulamak ve tipik sonuçlar görüntülemek için kullanılabilir göstermek, bir nörovasküler kaplin ajan olarak potasyum test ve Kir2 içe doğrulayan potasyum kanal ailesinin son karakterize inhibitörü etkisi de dahil olmak üzere, ML133. Ayrıca, erkek ve dişi farelerden elde edilen preparatlarda yanıtları karşılaştırıyoruz. Bu veriler fonksiyonel araştırmaları yansıtırken, yaklaşımımız moleküler biyoloji, immünkimya ve elektrofizyoloji çalışmalarında da kullanılabilir.

Introduction

Beyin yüzeyinde pial dolaşım çok çalışmanın nesnesi olmuştur, kısmen deneysel erişilebilirlik nedeniyle. Ancak serebral vaskülatürün topolojisi farklı bölgeler oluşturur. Kan akışını yönlendirmek için önemli kapasite ile anastomozlar açısından zengin sağlam pial ağ aksine, intraserebral parenkimal arterioller (PAs) mevcut sınırlı teminat kaynağı, her biri sinirdokusununayrı bir hacim perfüzyon 1,2. Bu, benzersiz fizyolojik özellikleri ile birlikte3,4,5,6,7,8, intraserebral arterioller serebral kan akımı için önemli bir site yapar kan akışı üzerinde bir darboğaz etkisi oluşturur (CBF) yönetmelik9,10. Izolasyon ve PAs cannülasyonu doğasında teknik zorluklara rağmen, son on yılda basınçlıkaplar 11 ,12,13,14,15,16,17kullanarak ex vivo fonksiyonel çalışmalarda artan bir ilgi gördü. Bu artan ilgi nin nedenlerinden biri nörovasküler kaplin (NVC), beyin fonksiyonel hiperemi18sürdüren mekanizma üzerinde yürütülen önemli araştırma çabasıdır.

Bölgesel olarak, CBF hızla lokal nöral aktivasyon19aşağıdaki artabilir. NVC’yi kontrol eden hücresel mekanizmalar ve sinyal özellikleri tam olarak anlaşılamamıştır. Ancak, nöral aktivite algılama ve yukarı arteriyol20,21,22dilate bir hiperpolarize elektrik sinyali içine çevirerek NVC sırasında beyin kılcal damarları için daha önce beklenmedik bir rol tespit . Eylem potansiyelleri23,24 ve astrositik endfeet üzerinde büyük iletkenlik Ca2 +aktive K+ (BK) kanallarının açılması25,26 interstisyel potasyum iyon konsantrasyonu artırmak [K+]o, hangi kılcal damar damar endotel güçlü içe doğrulayıcı K+ (Kir) kanallarının aktivasyonu ile sonuçlanır. Bu kanal harici K+ tarafından değil, aynı zamanda hiperpolarizasyon kendisi tarafından aktive edilir. Boşluk kavşakları ile yayılan, hiperpolarize akım sonra arteriyol kadar komşu kapiller endotel hücrelerinde yeniler, nerede miyosit gevşeme ve CBF artış nedenolur 20,21. Bu mekanizmanın çalışması bize vazoaktif ajanlar ile kapiller stimülasyon sırasında arterioler çapı ölçmek için basınçlı kapiller-parankimal arteriyol (CaPA) hazırlık geliştirmek için yol açtı. CaPA preparat bozulmamış bir kanüle intraserebral arteriyol segmenti oluşur, aşağı kapiller ramification. Kılcal uçlar bir mikropipet ile oda cam alt karşı sıkıştırılır, hangi tıkabasır ve tüm vasküler oluşumu stabilize20,21.

Daha önce fare korteks20,21 ve sıçan amigdala13 ve hipokampus16,17arteriyollerden CaPA preparatları görüntüleyerek enstrümantal yenilikler yaptık. Hipokampal vaskülatür patolojik koşullara yatkınlığı nedeniyle daha fazla dikkat alır gibi, burada fare hipokampus CaPA hazırlık için bir adım adım yöntem sağlamak (HiCaPA) sadece fonksiyonel NVC çalışmalarda değil, aynı zamanda moleküler biyoloji, immünokimya ve elektrofizyoloji kullanılabilir.

Protocol

Tüm deneyler Colorado Üniversitesi, Anschutz Tıp Kampüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri yönergelerine göre yapıldı. 1. Çözümler Diseksiyon için MOPS-tamponlu tuzlu kullanın ve numuneleri kullanılmadan önce 4 °C’de tutun. Çözeltiye gaz yapmayın. Aşağıdaki bileşimi ile MOPS tamponlu tuzlu hazırlayın: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 2.5 …

Representative Results

Endotel küçük iletkenliği (SK) ve ara iletkenlik (IK) Ca2+duyarlı K+ kanalları PA’ların çapı üzerinde dilatrasyon etkisi uygular. Sentetik IK ve SK kanal agonisti olan 1 μM NS309’un banyo uygulaması maksimal genişlemeye neden olur(Şekil 2A,B). Ancak, kapiller endotel hücreleri IK ve SK kanalları eksikliği ve NS30920yanıt olarak hiperpolarize vermedi. Sonuç olarak, fokal basınç…

Discussion

Bu el yazmasında açıklanan basınçlı HiCaPA (hipokampal kapiller-parenkimal arteriyol) hazırlığı, parenkimal arteriyol29’u izole etmek, basınçlandırmak ve çalışma prosedürümüzün bir uzantısıdır29. Yakın zamanda beyin kapiller endotel hücrelerinde Kir2.1 kanallarının sinirsel aktivasyonile ilişkili [K+]o hissartışları olduğunu ve yukarı yayılan arteriyoles20’yigenişleten bir hiperpolarize sinyal ürettiğini bildirdik. …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, Jules Morin’e el yazması hakkındaki anlayışlı yorumları için teşekkür etmek isterler. Bu araştırma, KAR Amacı Gütmeyen Umut Organizasyonumuz, Kadın Sağlığı ve Araştırma Merkezi ve NHLBI R01HL136636 (FD) tarafından finanse edilmiştir.

Materials

0.22µm Syringe Filters CELLTREAT Scientific Products 229751
12-0 Nylon (12cm) Black Microsurgery Instruments, Inc S12-0 NYLON
Automatic Temperature Controller Warner Instruments TC-324B
Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm Sutter Instruments B120-69-10
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7030
CaCl2 dihydrate Sigma-Aldrich C3881
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767
Dissection Scope Olympus SZ11
ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head Ismatec ISM 1090
EGTA Sigma-Aldrich E4378
Fine Scissors – Sharp Fine Science Tools 14063-09
Inline Water Heater Warner Instruments SH-27B
Integra™ Miltex™Tissue Forceps Fisher Scientific 12-460-117
KCl Sigma-Aldrich P9333
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich M1880
MgCl Anhydrous Sigma-Aldrich M8266
Micromanipulator Narishige MN-153
ML 133 hydrochloride Tocris 4549
MOPS Sigma-Aldrich M1254
NaCl Sigma-Aldrich S9625
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638
NaHCO3 Sigma-Aldrich S8875
NS309 Tocris 3895
Picospritzer III – Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel Parker Hannifin 052-0500-900
Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump Living Systems Instrumentation PS-200
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P3662
Super Fine Forceps Fine Science Tools 11252-20
Surgical Scissors – Sharp-Blunt Fine Science Tools 14001-13
Vertical Micropipette Puller Narishige PP-83
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).
  2. Shih, A. Y., et al. Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).
  3. Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
  4. Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).
  5. Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).
  6. Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).
  7. Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
  8. De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
  9. Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).
  10. Koide, M., et al. The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 25 (1), (2018).
  11. Girouard, H., et al. Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).
  12. Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).
  13. Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).
  14. Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).
  15. Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).
  16. Johnson, A. C., Cipolla, M. J. Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).
  17. Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. , (2019).
  18. Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
  19. Roy, C. S., Sherrington, C. S. On the Regulation of the Blood-supply of the Brain. The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).
  20. Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
  21. Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).
  22. Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells. eLife. 7, 351 (2018).
  23. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
  24. Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion. The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).
  25. Filosa, J. A., et al. Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain. Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).
  26. Attwell, D., et al. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
  27. Coyle, P. Vascular patterns of the rat hippocampal formation. Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).
  28. Wang, H. R., et al. Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133. ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).
  29. Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles. Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).
  30. Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).
  31. Montagne, A., et al. Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus. Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).
  32. Zhang, X., et al. Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).
  33. Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).

Tags

Ex VivoHippocampal Capillary-parenchymal ArterioleFunctional StudyDissectionMouse BrainHippocampusArteriole IsolationTransverse ArteryMOPS Buffered SalineCerebellumThalamusCorpus CallosumCerebrum
check_url/pt/60676?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study. J. Vis. Exp. (154), e60676, doi:10.3791/60676 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image