JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

De CryoAPEX-methode voor elektronenmicroscopieanalyse van membraaneiwitlokalisatie binnen ultrastructureel bewaarde cellen

Published: February 27, 2020
doi:
10.3791/60677
, , ,
1Department of Biological Sciences,Purdue University, 2Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology,Purdue University, 3Purdue Institute of Inflammation, Immunology and Infectious Disease,Purdue University, 4Bindley Biosciences Center,Purdue University, 5Purdue Institute of Integrative Neuroscience,Purdue University, 6Purdue Center for Cancer Research,Purdue University

Summary

Dit protocol beschrijft de cryoAPEX-methode, waarbij een APEX2-gelabeld membraaneiwit kan worden gelokaliseerd door transmissieelektronenmicroscopie binnen een optimaal bewaarde celultrastructuur.

Abstract

Belangrijke cellulaire gebeurtenissen zoals signaaltransductie en membraanhandel vertrouwen op de juiste eiwitlocatie in cellulaire compartimenten. Inzicht in nauwkeurige subcellulaire lokalisatie van eiwitten is dus belangrijk voor het beantwoorden van veel biologische vragen. De zoektocht naar een robuust label om eiwitlokalisatie te identificeren in combinatie met voldoende cellulaire conservering en kleuring is historisch uitdagend. Recente vooruitgang in elektronenmicroscopie (EM) beeldvorming heeft geleid tot de ontwikkeling van vele methoden en strategieën om cellulaire conservering te verhogen en het label doel eiwitten. Een relatief nieuwe peroxidase-gebaseerde genetische tag, APEX2, is een veelbelovende leider in kloonbare EM-actieve tags. Monstervoorbereiding voor transmissieelektronenmicroscopie (TEM) is de laatste jaren ook gevorderd met de komst van cryofixatie door hoge drukbevriezing (HPF) en uitdroging en vlekken bij lage temperaturen via vriessubstitutie (FS). HPF en FS bieden een uitstekende bewaring van cellulaire ultrastructuur voor TEM-beeldvorming, op de tweede plaats om cryo-beeldvorming van glasachtige monsters te direct. Hier presenteren we een protocol voor de cryoAPEX methode, die het gebruik van de APEX2 tag combineert met HPF en FS. In dit protocol wordt een eiwit van belang getagd met APEX2, gevolgd door chemische fixatie en de peroxidase reactie. In plaats van traditionele vlekken en alcohol uitdroging bij kamertemperatuur, het monster is cryofixed en ondergaat uitdroging en vlekken bij lage temperatuur via FS. Met behulp van cryoAPEX kan niet alleen een eiwit van belang worden geïdentificeerd in subcellulaire compartimenten, maar ook aanvullende informatie kan worden opgelost met betrekking tot de topologie binnen een structureel bewaard membraan. We tonen aan dat deze methode een hoge resolutie kan bieden om eiwitverdelingspatronen binnen een organellelumen te ontcijferen en om de compartimentering van een eiwit binnen één organelle te onderscheiden in de nabijheid van andere niet-gelabelde organellen. Verder is cryoAPEX procedureel eenvoudig en vatbaar voor cellen die in de weefselkweek worden gekweekt. Het is technisch niet uitdagender dan typische cryofixatie- en vriessubstitutiemethoden. CryoAPEX is op grote schaal toepasbaar voor TEM-analyse van membraaneiwit dat genetisch kan worden getagd.

Introduction

Biologische studies omvatten vaak vragen over het oplossen van subcellulaire eiwitlokalisatie in cellen en organellen. Immunofluorescentie microscopie biedt een nuttige lage resolutie weergave van eiwitlokalisatie, en de recente vooruitgang in super-resolutie beeldvorming duwen de grenzen van de resolutie voor fluorescerende gelabelde eiwitten1,2,3. Echter, elektronenmicroscopie (EM) blijft de gouden standaard voor beeldvorming hoge resolutie cellulaire ultrastructuur, hoewel de etikettering van eiwitten is een uitdaging.

Historisch gezien zijn verschillende EM-methoden gebruikt om vragen van ultrastructurele eiwitlokalisatie te benaderen. Een van de meest gebruikte methoden is immuno-elektronenmicroscopie (IEM), waarbij antigeenspecifieke primaire antilichamen worden gebruikt om het eiwit van belang te detecteren. EM-signaal wordt gegenereerd door de toepassing van secundaire antilichamen die zijn vervoegd met elektronendichte deeltjes, meestal colloïdaal goud4,5. Afwisselend kunnen antilichamen die zijn vervoegd met enzymen zoals mierikswortel peroxidase (HRP) worden gebruikt om een elektronendicht neerslag te produceren6,7,8. Er bestaan twee belangrijke benaderingen voor IEM, de zogenaamde pre-embedding en post-embeding labeling. Bij pre-inbedding van IEM worden antilichamen rechtstreeks in cellen geïntroduceerd, wat lichte fixatie en permeabilisatie van de cellen9,10,11noodzakelijk maakt. Beide stappen kunnen ultrastructuur12,13beschadigen. De ontwikkeling van aanzienlijk kleinere antilichamen bestaande uit een antilichaam Fab fragment vervoegd met 1,4 nm nanogoud maakt het mogelijk zeer zachte permeabilisatie voorwaarden te gebruiken; nanogold is echter te klein voor directe visualisatie onder TEM en vereist extra verbeteringsstappen om zichtbaar te worden14,15,16. Bij post-inbedding IEM worden antilichamen aangebracht op dunne delen van cellen die volledig zijn verwerkt door fixatie, uitdroging en inbedding in hars17. Hoewel deze aanpak de permeabilisatiestap vermijdt, is het behoud van de epitoop van belang tijdens de steekproefvoorbereiding een uitdaging18,19,20. De Tokuyasu-methode van lichtfixatie gevolgd door bevriezing, cryo-sectioning en antilichaamdetectie zorgt voor een verbeterde epitoopconservering21,22. De technische vereisten van cryo-ultramicrotomie en het suboptimale contrast in de cel zijn echter nadelen23.

Het gebruik van genetisch gecodeerde tags elimineert veel van de moeilijkheden van IEM in verband met de detectie van het eiwit van belang. Er zijn verschillende tags beschikbaar, waaronder HRP, ferritine, ReAsH, miniSOG en metallothionein24,25,26,27,28,29,30,31,32. Elk van deze heeft voordelen ten opzichte van eerdere methoden, maar elk heeft ook nadelen voorkomen wijdverbreid gebruik. Deze nadelen variëren van inactiviteit van HRP in de cytosol tot de grote omvang van de ferritinetag, lichtgevoeligheid van ReAsH en kleine omvang en gebrek aan compatibiliteit met cellulaire vlekken van metallothionein. Onlangs is een eiwit afkomstig van ascorbaat peroxidase ontworpen als een EM-tag, genaamd APEX233,34. Als peroxidase kan APEX2 de oxidatie van 3,3′ diaminobenzidine (DAB) katalyseren, waardoor een neerslag ontstaat dat reageert met osmium tetroxide om lokaal EM-contrast te bieden met minimale diffusie van het eiwit van belang (minder dan 25 nm)33,35. In tegenstelling tot traditionele HRP-gebaseerde methoden is APEX2 uiterst stabiel en blijft het actief in alle cellulaire compartimenten33. Monsters kunnen voor TEM worden verwerkt met behulp van traditionele EM-monsterkleuring en methoden die een goede visualisatie van de omringende structuren mogelijk maken33,34,36. Door zijn kleine omvang, stabiliteit en veelzijdigheid is APEX2 uitgegroeid tot een EM-tag met een groot potentieel.

Veel van de hierboven besproken benaderingen kunnen of zijn nog niet gecombineerd met de huidige stand van de techniek in ultrastructurele conservering, cryofixatie en lage temperatuur vriessubstitutie. Zo hebben ze last van een gebrek aan membraanbehoud en/of celkleuring om nauwkeurige eiwitlokalisatie te bepalen. Dit beperkt noodzakelijkerwijs de resolutie en interpretatie van de gegevens die kunnen worden verkregen. Cryofixatie door hoge druk bevriezing (HPF) omvat een snelle bevriezing van monsters in vloeibare stikstof bij een hoge druk (~ 2.100 bar), die vitrificatie veroorzaakt in plaats van kristallisatie van waterige monsters, waardoor cellen in een bijna-inheemse toestand37,38,39. HPF wordt gevolgd door vriessubstitutie (FS), een lage temperatuur (-90 °C) uitdroging in aceton in combinatie met incubatie met typische EM-vlekken zoals osmium tetroxide en uranylacetaat. HPF en FS samen bieden een duidelijk voordeel ten opzichte van de traditionele chemische fixatie (een langer proces dat kan leiden tot artefacten) en alcohol uitdroging bij kamertemperatuur of op ijs (wat kan leiden tot extractie van lipiden en suikers), en dus wenselijk zijn om te combineren met de beste EM-tags voor eiwitdetectie.

Een van de redenen dat HPF/FS niet is gecombineerd met APEX2-etikettering is dat lichte chemische fixatie een voorwaarde is voor de peroxidasereactie, waardoor de verspreiding van het DAB-reactieproduct wordt beperkt. In APEX2-studies tot nu toe worden fixatie en peroxidasereactie gevolgd door traditionele EM-methoden voor kleuring en alcoholuitdroging33,36. Er is echter aangetoond dat het volgen van chemische fixatie met HPF/FS een duidelijk voordeel biedt bij het behoud ten opzichte van traditionele chemische fixatie en alcoholuitdroging alleenal 40. Het verlies van ultrastructurele integriteit gezien in de traditionele TEM monsters lijkt minder verbonden met fixatie dan met uitdroging, die meestal wordt gedaan met behulp van alcohol bij kamertemperatuur of op ijs, en kan leiden tot extractie van lipiden en suikers40,41. Om de cryoAPEX-methode te ontwikkelen, veronderstelden we dat chemische fixatie en peroxidasereactie, gevolgd door HPF en FS, een optimaal resultaat zou opleveren in termen van ultrastructurele conservering.

Hier presenteren we het cryoAPEX-protocol, dat APEX2-tagging combineert met cryofixatie- en vriessubstitutiemethoden(figuur 1). Dit eenvoudige protocol bestaat uit transfection van een APEX2-gelabeld eiwit van belang, chemische fixatie van cellen, en de peroxidase reactie. HPF en FS worden vervolgens uitgevoerd, gevolgd door typische hars inbedding en dunne delen. TEM imaging onthult een uitstekende bewaring van ultrastructuur met behulp van deze methode. Daarnaast werden subcellulaire lokalisatie met hoge resolutie en ruimtelijke verdeling van een endoplasmische reticulum (ER) luminaaleiwit waargenomen. Deze methode is op grote schaal nuttig voor de detectie van membraan eiwitlokalisatie binnen cellen voor elektronenmicroscopie analyse. In onze handen, heeft de methode met succes gewerkt voor een verscheidenheid van cellijnen geteeld in weefselcultuur, met inbegrip van HEK-293T (menselijke embryonale nier), HeLa (menselijke baarmoederhalskanker), Cos7 (Afrikaanse groene aap nier fibroblast), en BHK (baby hamster nier). Gedetailleerde instructies worden hieronder beschreven met behulp van HEK-293T cellen.

Protocol

1. Celcultuur en transfection Zaad HEK-293T cellen met een diameter van 60 mm of grotere weefselkweekschotel en groeien tot 60%-90% samenvloeiing in een celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2. Transfect-cellen met APEX2-gelabelde zoogdierexpressieplasmiden met transfection reagens (zie Tabel met materialen)volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Bij 12-15 uur na het transfectie, wascellen eenmaal met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder cellen uit d…

Representative Results

Om de ultrastructurele conservering met behulp van de cryoAPEX-methode te vergelijken met traditionele fixatie en uitdroging, hebben we monsters gemaakt waarin een endoplasmatisch reticulum membraan (ERM; ER membraan) peptide werd gelabeld met APEX2 en omgezet in HEK-293T cellen. ERM-APEX2 lokaliseert het cytoplasmatische gezicht van de ER en hermodelleert de ER-structuur tot morfologische verschillende structuren die bekend staan als georganiseerde gladde ER (OSER)34,…

Discussion

Het hier gepresenteerde cryoAPEX-protocol biedt een robuuste methode om de lokalisatie van membraaneiwitten in de cellulaire omgeving te karakteriseren. Niet alleen zorgt het gebruik van een genetisch gecodeerde APEX2-tag voor nauwkeurige lokalisatie van een eiwit van belang, maar het gebruik van cryofixatie en uitdroging bij lage temperaturen zorgt voor een uitstekende bewaring en kleuring van de omringende cellulaire ultrastructuur. Gecombineerd zijn deze benaderingen een krachtig hulpmiddel voor het lokaliseren van ee…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Het hier beschreven protocol komt voort uit een publicatie van Sengupta et al., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs222315 (2019)48. Dit werk wordt ondersteund door subsidies R01GM10092 (aan S.M.) en AI081077 (R.V.S.) van de National Institutes of Health, CTSI-106564 (aan S.M.) van Indiana Clinical and Translational Sciences Institute, en PI4D-209263 (naar S.M.) van het Purdue University Institute for Inflammation, Immunology, and Infectious Disease.

Materials

3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate Sigma-Aldrich D5637-1G
Acetone (Glass Distilled) Electron Microscopy Sciences 10016
Beakers; Plastic, Disposable 120 cc Electron Microscopy Sciences 60952
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-100G
Cryogenic Storage Vials, 2 mL VWR 82050-168
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Corning 10-017-CV
Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin Sigma-Aldrich 44611-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964 Sigma-Aldrich 44612-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060) Sigma-Aldrich 44613-100ML
Durcupan ACM Fluka,single component D Sigma-Aldrich 44614-100ML
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm Electron Microscopy Sciences 70901
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm Electron Microscopy Sciences 70900
Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement Corning 355104
Glass Knife Boats, 6.4 mm Electron Microscopy Sciences 71008
Glass Knifemaker Leica Microsystems EM KMR3
Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 16120
HEK 293 Cells ATCC CRL-1573
High Pressure Freezer with Rapid Transfer System Leica Microsystems EM PACT2 Archived Product Replaced by Leica EM ICE
Hydrogen Peroxide 30% Solution Fisher Scientific 50-266-27
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific L3000015
Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm Mager Scientific 16707898
Osmium Tetroxide, crystalline Electron Microscopy Sciences 19110
Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade VWR 97062-950
Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm Mager Scientific 16702738
Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film Electron Microscopy Sciences FF2010-Cu
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4 Electron Microscopy Sciences 102090-962
Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS) Avantor Macron Fine Chemicals 7708-10
Tannic Acid Electron Microscopy Sciences 21710
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm VWR 25382-166
Ultra Glass Knife Strips Electron Microscopy Sciences 71012
Ultramicrotome Leica Microsystems EM UC7
Uranyl Acetate Dihydrate Electron Microscopy Sciences 22400
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-Resolution Fluorescence Microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
  2. Sydor, A. M., Czymmek, K. J., Puchner, E. M., Mennella, V. Super-Resolution Microscopy From Single Molecules to Supramolecular Assemblies. Trends in Cell Biology. 25, 730-748 (2015).
  3. Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6, 022003 (2018).
  4. De Mey, J., Moeremans, M., Geuens, G., Nuydens, R., De Brabander, M. High resolution light and electron microscopic localization of tubulin with the IGS (Immuno Gold Staining) method. Cell Biology International Reports. 5, 889-899 (1981).
  5. Faulk, W., Taylor, G. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  6. Brown, W. J., Constantinescu, E., Farquhar, M. G. Redistribution of Mannose-6-Phosphate Receptors Induced by Tunicamycin and Chloroquine. The Journal of Cell Biology. 99, 320-326 (1984).
  7. Brown, W. J., Farquhar, M. G. The Mannose-6-phosphate Enzymes Is Concentrated Receptor for Lysosomal in Cis Golgi Cisternae. Cell. 36, 295-307 (1984).
  8. Sternberger, L. A., Hardy, P. H., Cuculis, J. J., Meyer, H. G. The unlabeled antibody enzyme method of immunohistochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 18, 315-333 (1970).
  9. Oliver, C., Oliver, C., Jamur, M. C. Pre-embedding Labeling Methods. Immunocytochemical Methods and Protocols. 588, 381-386 (2010).
  10. Polishchuk, E. V., Polishchuk, R. S. Pre-embedding labeling for subcellular detection of molecules with electron microscopy. Tissue and Cell. 57, 103-110 (2019).
  11. Polishchuk, R. S., Polishchuk, E. V., Luini, A., Mueller-Reichert, T., Verkade, P. Visualizing Live Dynamics and Ultrastructure of Intracellular Organelles with Preembedding Correlative Light-Electron Microscopy. Correlative Light and Electron Microscopy. 111, 21-35 (2012).
  12. Humbel, B. M., De Jong, M. D. M., Müller, W. H., Verkleij, A. J. Pre-embedding immunolabeling for electron microscopy: An evaluation of permeabilization methods and markers. Microscopy Research and Technique. 42, 43-58 (1998).
  13. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9, 152-158 (2012).
  14. Hainfeld, J. F., Powell, R. D. New Frontiers in Gold Labeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48, 471-480 (2000).
  15. Hainfeld, J. F., Furuya, F. R. A 1.4-nm Gold Cluster Covalently Attached to Antibodies Improves Immunolabeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40, 177-184 (1992).
  16. Baschong, W., Stierhof, Y. Preparation, Use, and Enlargement of Ultrasmall Gold Particles in Immunoelectron Microscopy. Microscopy Research and Technique. 42, 66-79 (1998).
  17. Roth, J., Bendayan, M., Orci, L. Ultrastructural loclaization of intracellular antigens by the use of Protein A-gold complex. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 26, 1074-1081 (1978).
  18. Armbruster, B. L., et al. Specimen preparation for electron microscopy using low temperature embedding resins. Journal of Microscopy. 126, 77-85 (1982).
  19. Fowler, C. B., Leary, T. J. O., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and histological processing with ribonuclease A effects of ethanol dehydration on reversal of formaldehyde cross-links. Laboratory Investigation. 88, 785-791 (2008).
  20. Newman, G. R., Hobot, J. A. Modern Acrylics for Post-embedding Immunostaining Techniques. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35, 971-981 (1987).
  21. Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. The Journal of Cell Biology. 57, 551-565 (1973).
  22. Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143, 139-149 (1986).
  23. Möbius, W., Posthuma, G. Sugar and ice Immunoelectron microscopy using cryosections according to the Tokuyasu method. Tissue and Cell. 57, 90-102 (2019).
  24. Gaietta, G., et al. Multicolor and Electron Microscopic Imaging of Connexin Trafficking. Science. 296, 503-508 (2002).
  25. Uttamapinant, C., et al. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 10914-10919 (2010).
  26. Porstmann, B., Porstmann, T., Nugel, E., Evers, U. Which of the Commonly Used Marker Enzymes Gives the Best Results in Colorimetric and Fluorimetric Enzyme Immunoassays: Horseradish Peroxidase, Alkaline Phosphatase or Beta-Galactosidase. Journal of Immunological Methods. 79, 27-37 (1985).
  27. Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS Biology. 9, 1001041 (2011).
  28. Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160, 70-82 (2007).
  29. Wang, Q., Mercogliano, C. P., Löwe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19, 147-154 (2011).
  30. Risco, C., et al. Specific, sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20, 759-766 (2012).
  31. Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. E., Thorner, J., Emr, S. D., Abelson, J. N. Chimeric Molecules Employing Horseradish Peroxidase as Reporter Enzyme for Protein Localization in the Electron Microscope. Methods in Enzymology. 327, 35-45 (2000).
  32. Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetrcysteine-tagged proteins in intact cells. Nature Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
  33. Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30, 1143-1150 (2012).
  34. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12, (2015).
  35. Ariotti, N., et al. Modular Detection of GFP-Labeled Proteins for Rapid Screening by Electron Microscopy in Cells and Organisms. Developmental Cell. 35, 513-525 (2015).
  36. Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12, 1792-1816 (2017).
  37. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: Bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130, 877-889 (2008).
  38. Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure Freezing for the Preservation of Biological Structure: Theory and Practice. Journal of Electron Microscopy Technique. 13, 165-174 (1989).
  39. McDonald, K. L., Hajibagheri, N. High-Pressure Freezing for Preservation of High Resolution Fine Structure and Antigenicity for Immunolabeling. Electron Microscopy Methods and Protocols. 117, 77-97 (1999).
  40. Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161, 359-371 (2008).
  41. Korn, E. D., Weisman, R. A. Loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochemica et Biophysica Acta. 116, 309-316 (1966).
  42. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. Journal of Cell Biology. 163, 257-269 (2003).
  43. Sandig, G., et al. Regulation of endoplasmic reticulum biogenesis in response to cytochrome P450 overproduction. Drug Metabolism Reviews. 31, 393-410 (1999).
  44. Faber, P. W., et al. Huntingtin interacts with a family of WW domain proteins. Human Molecular Genetics. 7, 1463-1474 (1998).
  45. Worby, C. A., et al. Article The Fic Domain Regulation of Cell Signaling by Adenylylation. Molecular Cell. 34, 93-103 (2009).
  46. Sanyal, A., et al. A Novel Link between Fic (Filamentation Induced by cAMP) – mediated Adenylylation / AMPylation and the Unfolded Protein Response. The Journal of Biological Chemistry. 290, 8482-8499 (2015).
  47. Mattoo, S., et al. Comparative Analysis of Histophilus somni Immunoglobulin-binding Protein A (IbpA) with Other Fic Domain-containing Enzymes Reveals Differences in Substrate and Nucleotide Specificities. The Journal of Biological Chemistry. 286, 32834-32842 (2011).
  48. Sengupta, R., Poderycki, M. J., Mattoo, S. CryoAPEX – an electron tomography tool for subcellular localization of membrane proteins. Journal of Cell Science. 132, 222315 (2019).
  49. Tsang, T. K., et al. High-quality ultrastructural preservation using cryofixation for 3D electron microscopy of genetically labeled tissues. eLife. 7, 1-23 (2018).
  50. Giddings, T. H. Freeze-substitution protocols for improved visualization of membranes in high-pressure frozen samples. Journal of Microscopy. 212, 53-61 (2003).
  51. McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243, 227-233 (2011).
  52. McDonald, K. Cryopreparation methods for electron microscopy of selected model systems. Methods in Cell Biology. 79, 23-56 (2007).
  53. Buser, C., Walther, P. Freeze-substitution: the addition of water to polar solvents enhances the retention of structure and acts at temperatures around -60 degrees C. Journal of Microscopy. 230, 268-277 (2008).
  54. Jiménez, N., et al. Tannic acid-mediated osmium impregnation after freeze-substitution A strategy to enhance membrane contrast for electron tomography. Journal of Structural Biology. 166, 103-106 (2009).
  55. Han, Y., et al. Directed Evolution of Split APEX2 Peroxidase. ACS chemical biology. 14, 619-635 (2019).
  56. Kuipers, J., Van Ham, T. J., Kalicharan, R. D., Schnell, U., Giepmans, B. N. G. FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles. Cell Tissue Research. 360, 61-70 (2015).
  57. Zhou, Y., et al. Expanding APEX2 Substrates for Spatial-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins in Living Cells. Angewandte Chemie. , (2019).
  58. Joesch, M., et al. Reconstruction of genetically identified neurons imaged by serial-section electron microscopy. eLife. 5, 1-13 (2016).

Tags

CryoAPEXElectron MicroscopyMembrane Protein LocalizationUltrastructural PreservationAPEX2CryofixationFreeze SubstitutionVirus ReplicationBacterial ToxinGolgi Fragmentation
check_url/pt/60677?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Mihelc, E. M., Angel, S., Stahelin, R. V., Mattoo, S. The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells. J. Vis. Exp. (156), e60677, doi:10.3791/60677 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image