Dit protocol beschrijft de cryoAPEX-methode, waarbij een APEX2-gelabeld membraaneiwit kan worden gelokaliseerd door transmissieelektronenmicroscopie binnen een optimaal bewaarde celultrastructuur.
Belangrijke cellulaire gebeurtenissen zoals signaaltransductie en membraanhandel vertrouwen op de juiste eiwitlocatie in cellulaire compartimenten. Inzicht in nauwkeurige subcellulaire lokalisatie van eiwitten is dus belangrijk voor het beantwoorden van veel biologische vragen. De zoektocht naar een robuust label om eiwitlokalisatie te identificeren in combinatie met voldoende cellulaire conservering en kleuring is historisch uitdagend. Recente vooruitgang in elektronenmicroscopie (EM) beeldvorming heeft geleid tot de ontwikkeling van vele methoden en strategieën om cellulaire conservering te verhogen en het label doel eiwitten. Een relatief nieuwe peroxidase-gebaseerde genetische tag, APEX2, is een veelbelovende leider in kloonbare EM-actieve tags. Monstervoorbereiding voor transmissieelektronenmicroscopie (TEM) is de laatste jaren ook gevorderd met de komst van cryofixatie door hoge drukbevriezing (HPF) en uitdroging en vlekken bij lage temperaturen via vriessubstitutie (FS). HPF en FS bieden een uitstekende bewaring van cellulaire ultrastructuur voor TEM-beeldvorming, op de tweede plaats om cryo-beeldvorming van glasachtige monsters te direct. Hier presenteren we een protocol voor de cryoAPEX methode, die het gebruik van de APEX2 tag combineert met HPF en FS. In dit protocol wordt een eiwit van belang getagd met APEX2, gevolgd door chemische fixatie en de peroxidase reactie. In plaats van traditionele vlekken en alcohol uitdroging bij kamertemperatuur, het monster is cryofixed en ondergaat uitdroging en vlekken bij lage temperatuur via FS. Met behulp van cryoAPEX kan niet alleen een eiwit van belang worden geïdentificeerd in subcellulaire compartimenten, maar ook aanvullende informatie kan worden opgelost met betrekking tot de topologie binnen een structureel bewaard membraan. We tonen aan dat deze methode een hoge resolutie kan bieden om eiwitverdelingspatronen binnen een organellelumen te ontcijferen en om de compartimentering van een eiwit binnen één organelle te onderscheiden in de nabijheid van andere niet-gelabelde organellen. Verder is cryoAPEX procedureel eenvoudig en vatbaar voor cellen die in de weefselkweek worden gekweekt. Het is technisch niet uitdagender dan typische cryofixatie- en vriessubstitutiemethoden. CryoAPEX is op grote schaal toepasbaar voor TEM-analyse van membraaneiwit dat genetisch kan worden getagd.
Biologische studies omvatten vaak vragen over het oplossen van subcellulaire eiwitlokalisatie in cellen en organellen. Immunofluorescentie microscopie biedt een nuttige lage resolutie weergave van eiwitlokalisatie, en de recente vooruitgang in super-resolutie beeldvorming duwen de grenzen van de resolutie voor fluorescerende gelabelde eiwitten1,2,3. Echter, elektronenmicroscopie (EM) blijft de gouden standaard voor beeldvorming hoge resolutie cellulaire ultrastructuur, hoewel de etikettering van eiwitten is een uitdaging.
Historisch gezien zijn verschillende EM-methoden gebruikt om vragen van ultrastructurele eiwitlokalisatie te benaderen. Een van de meest gebruikte methoden is immuno-elektronenmicroscopie (IEM), waarbij antigeenspecifieke primaire antilichamen worden gebruikt om het eiwit van belang te detecteren. EM-signaal wordt gegenereerd door de toepassing van secundaire antilichamen die zijn vervoegd met elektronendichte deeltjes, meestal colloïdaal goud4,5. Afwisselend kunnen antilichamen die zijn vervoegd met enzymen zoals mierikswortel peroxidase (HRP) worden gebruikt om een elektronendicht neerslag te produceren6,7,8. Er bestaan twee belangrijke benaderingen voor IEM, de zogenaamde pre-embedding en post-embeding labeling. Bij pre-inbedding van IEM worden antilichamen rechtstreeks in cellen geïntroduceerd, wat lichte fixatie en permeabilisatie van de cellen9,10,11noodzakelijk maakt. Beide stappen kunnen ultrastructuur12,13beschadigen. De ontwikkeling van aanzienlijk kleinere antilichamen bestaande uit een antilichaam Fab fragment vervoegd met 1,4 nm nanogoud maakt het mogelijk zeer zachte permeabilisatie voorwaarden te gebruiken; nanogold is echter te klein voor directe visualisatie onder TEM en vereist extra verbeteringsstappen om zichtbaar te worden14,15,16. Bij post-inbedding IEM worden antilichamen aangebracht op dunne delen van cellen die volledig zijn verwerkt door fixatie, uitdroging en inbedding in hars17. Hoewel deze aanpak de permeabilisatiestap vermijdt, is het behoud van de epitoop van belang tijdens de steekproefvoorbereiding een uitdaging18,19,20. De Tokuyasu-methode van lichtfixatie gevolgd door bevriezing, cryo-sectioning en antilichaamdetectie zorgt voor een verbeterde epitoopconservering21,22. De technische vereisten van cryo-ultramicrotomie en het suboptimale contrast in de cel zijn echter nadelen23.
Het gebruik van genetisch gecodeerde tags elimineert veel van de moeilijkheden van IEM in verband met de detectie van het eiwit van belang. Er zijn verschillende tags beschikbaar, waaronder HRP, ferritine, ReAsH, miniSOG en metallothionein24,25,26,27,28,29,30,31,32. Elk van deze heeft voordelen ten opzichte van eerdere methoden, maar elk heeft ook nadelen voorkomen wijdverbreid gebruik. Deze nadelen variëren van inactiviteit van HRP in de cytosol tot de grote omvang van de ferritinetag, lichtgevoeligheid van ReAsH en kleine omvang en gebrek aan compatibiliteit met cellulaire vlekken van metallothionein. Onlangs is een eiwit afkomstig van ascorbaat peroxidase ontworpen als een EM-tag, genaamd APEX233,34. Als peroxidase kan APEX2 de oxidatie van 3,3′ diaminobenzidine (DAB) katalyseren, waardoor een neerslag ontstaat dat reageert met osmium tetroxide om lokaal EM-contrast te bieden met minimale diffusie van het eiwit van belang (minder dan 25 nm)33,35. In tegenstelling tot traditionele HRP-gebaseerde methoden is APEX2 uiterst stabiel en blijft het actief in alle cellulaire compartimenten33. Monsters kunnen voor TEM worden verwerkt met behulp van traditionele EM-monsterkleuring en methoden die een goede visualisatie van de omringende structuren mogelijk maken33,34,36. Door zijn kleine omvang, stabiliteit en veelzijdigheid is APEX2 uitgegroeid tot een EM-tag met een groot potentieel.
Veel van de hierboven besproken benaderingen kunnen of zijn nog niet gecombineerd met de huidige stand van de techniek in ultrastructurele conservering, cryofixatie en lage temperatuur vriessubstitutie. Zo hebben ze last van een gebrek aan membraanbehoud en/of celkleuring om nauwkeurige eiwitlokalisatie te bepalen. Dit beperkt noodzakelijkerwijs de resolutie en interpretatie van de gegevens die kunnen worden verkregen. Cryofixatie door hoge druk bevriezing (HPF) omvat een snelle bevriezing van monsters in vloeibare stikstof bij een hoge druk (~ 2.100 bar), die vitrificatie veroorzaakt in plaats van kristallisatie van waterige monsters, waardoor cellen in een bijna-inheemse toestand37,38,39. HPF wordt gevolgd door vriessubstitutie (FS), een lage temperatuur (-90 °C) uitdroging in aceton in combinatie met incubatie met typische EM-vlekken zoals osmium tetroxide en uranylacetaat. HPF en FS samen bieden een duidelijk voordeel ten opzichte van de traditionele chemische fixatie (een langer proces dat kan leiden tot artefacten) en alcohol uitdroging bij kamertemperatuur of op ijs (wat kan leiden tot extractie van lipiden en suikers), en dus wenselijk zijn om te combineren met de beste EM-tags voor eiwitdetectie.
Een van de redenen dat HPF/FS niet is gecombineerd met APEX2-etikettering is dat lichte chemische fixatie een voorwaarde is voor de peroxidasereactie, waardoor de verspreiding van het DAB-reactieproduct wordt beperkt. In APEX2-studies tot nu toe worden fixatie en peroxidasereactie gevolgd door traditionele EM-methoden voor kleuring en alcoholuitdroging33,36. Er is echter aangetoond dat het volgen van chemische fixatie met HPF/FS een duidelijk voordeel biedt bij het behoud ten opzichte van traditionele chemische fixatie en alcoholuitdroging alleenal 40. Het verlies van ultrastructurele integriteit gezien in de traditionele TEM monsters lijkt minder verbonden met fixatie dan met uitdroging, die meestal wordt gedaan met behulp van alcohol bij kamertemperatuur of op ijs, en kan leiden tot extractie van lipiden en suikers40,41. Om de cryoAPEX-methode te ontwikkelen, veronderstelden we dat chemische fixatie en peroxidasereactie, gevolgd door HPF en FS, een optimaal resultaat zou opleveren in termen van ultrastructurele conservering.
Hier presenteren we het cryoAPEX-protocol, dat APEX2-tagging combineert met cryofixatie- en vriessubstitutiemethoden(figuur 1). Dit eenvoudige protocol bestaat uit transfection van een APEX2-gelabeld eiwit van belang, chemische fixatie van cellen, en de peroxidase reactie. HPF en FS worden vervolgens uitgevoerd, gevolgd door typische hars inbedding en dunne delen. TEM imaging onthult een uitstekende bewaring van ultrastructuur met behulp van deze methode. Daarnaast werden subcellulaire lokalisatie met hoge resolutie en ruimtelijke verdeling van een endoplasmische reticulum (ER) luminaaleiwit waargenomen. Deze methode is op grote schaal nuttig voor de detectie van membraan eiwitlokalisatie binnen cellen voor elektronenmicroscopie analyse. In onze handen, heeft de methode met succes gewerkt voor een verscheidenheid van cellijnen geteeld in weefselcultuur, met inbegrip van HEK-293T (menselijke embryonale nier), HeLa (menselijke baarmoederhalskanker), Cos7 (Afrikaanse groene aap nier fibroblast), en BHK (baby hamster nier). Gedetailleerde instructies worden hieronder beschreven met behulp van HEK-293T cellen.
Het hier gepresenteerde cryoAPEX-protocol biedt een robuuste methode om de lokalisatie van membraaneiwitten in de cellulaire omgeving te karakteriseren. Niet alleen zorgt het gebruik van een genetisch gecodeerde APEX2-tag voor nauwkeurige lokalisatie van een eiwit van belang, maar het gebruik van cryofixatie en uitdroging bij lage temperaturen zorgt voor een uitstekende bewaring en kleuring van de omringende cellulaire ultrastructuur. Gecombineerd zijn deze benaderingen een krachtig hulpmiddel voor het lokaliseren van ee…
The authors have nothing to disclose.
Het hier beschreven protocol komt voort uit een publicatie van Sengupta et al., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs222315 (2019)48. Dit werk wordt ondersteund door subsidies R01GM10092 (aan S.M.) en AI081077 (R.V.S.) van de National Institutes of Health, CTSI-106564 (aan S.M.) van Indiana Clinical and Translational Sciences Institute, en PI4D-209263 (naar S.M.) van het Purdue University Institute for Inflammation, Immunology, and Infectious Disease.
3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | D5637-1G | |
Acetone (Glass Distilled) | Electron Microscopy Sciences | 10016 | |
Beakers; Plastic, Disposable 120 cc | Electron Microscopy Sciences | 60952 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
Cryogenic Storage Vials, 2 mL | VWR | 82050-168 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Corning | 10-017-CV | |
Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin | Sigma-Aldrich | 44611-500ML | |
Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964 | Sigma-Aldrich | 44612-500ML | |
Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060) | Sigma-Aldrich | 44613-100ML | |
Durcupan ACM Fluka,single component D | Sigma-Aldrich | 44614-100ML | |
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm | Electron Microscopy Sciences | 70901 | |
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm | Electron Microscopy Sciences | 70900 | |
Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement | Corning | 355104 | |
Glass Knife Boats, 6.4 mm | Electron Microscopy Sciences | 71008 | |
Glass Knifemaker | Leica Microsystems | EM KMR3 | |
Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 16120 | |
HEK 293 Cells | ATCC | CRL-1573 | |
High Pressure Freezer with Rapid Transfer System | Leica Microsystems | EM PACT2 | Archived Product Replaced by Leica EM ICE |
Hydrogen Peroxide 30% Solution | Fisher Scientific | 50-266-27 | |
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000015 | |
Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm | Mager Scientific | 16707898 | |
Osmium Tetroxide, crystalline | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade | VWR | 97062-950 | |
Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm | Mager Scientific | 16702738 | |
Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film | Electron Microscopy Sciences | FF2010-Cu | |
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 102090-962 | |
Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS) | Avantor Macron Fine Chemicals | 7708-10 | |
Tannic Acid | Electron Microscopy Sciences | 21710 | |
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm | VWR | 25382-166 | |
Ultra Glass Knife Strips | Electron Microscopy Sciences | 71012 | |
Ultramicrotome | Leica Microsystems | EM UC7 | |
Uranyl Acetate Dihydrate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |