Méthode CryoAPEX pour l’analyse de la microscopie électronique de la localisation des protéines membranaires dans les cellules ultrastructuralement conservées

Summary

Ce protocole décrit la méthode cryoAPEX, dans laquelle une protéine de membrane APEX2-étiquetée peut être localisée par microscopie électronique de transmission dans l’ultrastructure optimale-préservée de cellules.

Abstract

Les événements cellulaires clés comme la transduction du signal et le trafic de membranes dépendent d’un emplacement approprié des protéines dans les compartiments cellulaires. Comprendre la localisation sous-cellulaire précise des protéines est donc important pour répondre à de nombreuses questions biologiques. La recherche d’un label robuste pour identifier la localisation des protéines combinée à une conservation cellulaire adéquate et la coloration a été historiquement difficile. Les progrès récents de la microscopie électronique (EM) ont mené au développement de nombreuses méthodes et stratégies visant à accroître la préservation cellulaire et les protéines cibles d’étiquettes. ApEX2, une étiquette génétique relativement nouvelle à base de peroxidase, est un chef de file prometteur dans le domaine des étiquettes actives em.- cloables. La préparation de l’échantillon pour la microscopie électronique de transmission (TEM) a également progressé ces dernières années avec l’avènement de la cryofixation par congélation à haute pression (HPF) et la déshydratation à basse température et la coloration par substitution par congélation (FS). HPF et FS fournissent une excellente conservation de l’ultrastructure cellulaire pour l’imagerie TEM, en second lieu seulement à la cryo-imagerie directe des échantillons vitreux. Ici, nous présentons un protocole pour la méthode cryoAPEX, qui combine l’utilisation de l’étiquette APEX2 avec HPF et FS. Dans ce protocole, une protéine d’intérêt est étiquetée avec APEX2, suivie de la fixation chimique et de la réaction de peroxidase. Au lieu de la coloration traditionnelle et de la déshydratation de l’alcool à température ambiante, l’échantillon est cryofixe et subit une déshydratation et une coloration à basse température via FS. À l’aide de cryoAPEX, non seulement une protéine d’intérêt peut être identifiée dans les compartiments subcellulaires, mais aussi des informations supplémentaires peuvent être résolues en ce qui concerne sa topologie au sein d’une membrane structurellement préservée. Nous montrons que cette méthode peut fournir une résolution assez élevée pour déchiffrer les modèles de distribution de protéines dans un lumen organelle, et pour distinguer la compartimentation d’une protéine dans un organite à proximité d’autres organelles non étiquetées. En outre, cryoAPEX est procéduralement simple et favorable aux cellules cultivées dans la culture de tissu. Il n’est pas plus difficile techniquement que les méthodes typiques de cryofixation et de substitution de gel. CryoAPEX est largement applicable pour l’analyse TEM de toute protéine membranaire qui peut être génétiquement étiquetée.

Introduction

Les études biologiques incluent souvent des questions de résolution de la localisation subcellulaire des protéines dans les cellules et les organites. La microscopie d’immunofluorescence fournit une vue utile à basse résolution de la localisation des protéines, et les progrès récents dans l’imagerie de super-résolution repoussent les limites de la résolution pour les protéines fluorescentes étiquetées^1,2,3. Cependant, la microscopie électronique (EM) demeure l’étalon-or de l’imagerie de l’ultrastructure cellulaire à haute résolution, bien que l’étiquetage des protéines soit un défi.

Historiquement, plusieurs méthodes EM ont été utilisées pour aborder les questions de localisation des protéines ultrastructurales. L’une des méthodes les plus couramment utilisées est la microscopie immunoélectronique (IEM), où des anticorps primaires spécifiques à l’antigène sont utilisés pour détecter la protéine d’intérêt. Le signal EM est généré par l’application d’anticorps secondaires conjugués à des particules denses en électrons, le plus souvent l’or colloïdal^4,5. Alternativement, les anticorps conjugués avec des enzymes telles que le radis de cheval peroxidase (HRP) peuvent être utilisés pour produire un précipité dense en électrons^6,7,8. Deux approches principales existent pour l’IEM, appelée étiquetage pré-embedding et post-encastrage. Dans la pré-intégration IEM, les anticorps sont introduits directement dans les cellules, ce qui nécessite la fixation de la lumière et la perméabilisation des cellules^9,10,11. Les deux étapes peuvent endommager l’ultrastructure^12,13. Le développement d’anticorps significativement plus petits constitués d’un fragment d’anticorps Fab conjugué à 1,4 nm de nanogold permet d’utiliser des conditions de perméabilisation très douces; cependant, le nanogold est trop petit pour la visualisation directe sous TEM et nécessite des étapes supplémentaires d’amélioration pour devenir visible^14,15,16. Dans l’IEM post-incorporation, les anticorps sont appliqués sur les sections minces des cellules qui ont été entièrement traitées par fixation, déshydratation, et l’intégration dans la résine¹⁷. Bien que cette approche évite l’étape de perméabilisation, la préservation de l’épitope d’intérêt tout au long de la préparation de l’échantillon est difficile^18,19,20. La méthode Tokuyasu de fixation de la lumière suivie de la congélation, cryo-sectionnement, et la détection d’anticorps fournit la conservation améliorée d’épitope^21,22. Cependant, les exigences techniques de la cryo-ultramicrotomie, ainsi que le contraste sous-optimal atteint dans la cellule, sont des inconvénients²³.

L’utilisation d’étiquettes génétiquement codées élimine bon nombre des difficultés de l’IEM liées à la détection de la protéine d’intérêt. Une variété d’étiquettes sont disponibles, y compris HRP, ferritin, ReAsH, miniSOG, et metallothionein^{24,25,26,27,28,29,30,31,32}. Chacun e de ces avantages présente des avantages par rapport aux méthodes précédentes, mais chacune présente également des inconvénients empêchant une utilisation généralisée. Ces inconvénients vont de l’inactivité de HRP dans le cytosol à la grande taille de l’étiquette de ferritine, sensibilité à la lumière de ReAsH, et petite taille et le manque de compatibilité avec la coloration cellulaire de la métallothionein. Récemment, une protéine dérivée de l’ascorbate peroxidase a été conçue comme une étiquette EM, nommée APEX2^33,34. En peroxidase, APEX2 peut catalyser l’oxydation de 3,3′ diaminobenzidine (DAB), produisant un précipité qui réagit avec du tétroxide d’osmium pour fournir un contraste local EM avec une diffusion minimale de la protéine d’intérêt (moins de 25 nm)^33,35. Contrairement aux méthodes traditionnelles basées sur HRP, APEX2 est extrêmement stable et reste actif dans tous les compartiments cellulaires³³. Les échantillons peuvent être traités pour TEM à l’aide de la coloration traditionnelle de l’échantillon EM et des méthodes qui permettent une bonne visualisation des structures environnantes^33,34,36. En raison de sa petite taille, sa stabilité et sa polyvalence, APEX2 est devenu une étiquette EM à fort potentiel.

Bon nombre des approches mentionnées ci-dessus ne peuvent pas ou n’ont pas encore été combinées à l’état actuel de l’art en matière de préservation ultrastructurale, de cryofixation et de substitution par le gel à basse température. Ainsi, ils souffrent d’un manque de conservation de la membrane et / ou de coloration cellulaire pour déterminer la localisation précise des protéines. Cela limite nécessairement la résolution et l’interprétation des données qui peuvent être obtenues. La cryofixation par congélation à haute pression (HPF) implique une congélation rapide d’échantillons dans l’azote liquide à haute pression (2 100 barres), ce qui provoque la vitrification plutôt que la cristallisation des échantillons aqueux, préservant ainsi les cellules dans un état quasi-indigène^37,38,39. Le HPF est suivi d’une substitution par gel (FS), d’une déshydratation à basse température (-90 oC) en acétone combinée à l’incubation avec des taches EM typiques telles que le tétroxide d’osmium et l’acétate uranyl. HPF et FS fournissent ensemble un avantage distinct sur la fixation chimique traditionnelle (un processus plus long qui peut conduire à des artefacts) et la déshydratation de l’alcool à température ambiante ou sur la glace (qui peut conduire à l’extraction des lipides et des sucres), et sont donc souhaitables de combiner avec les meilleures étiquettes EM pour la détection des protéines.

Une des raisons pour lesquelles HPF/FS n’a pas été combiné avec l’étiquetage APEX2 est que la fixation chimique légère est une condition préalable à la réaction de peroxidase, limitant la diffusion du produit de réaction de DAB. Dans les études APEX2 jusqu’à présent, la fixation et la réaction peroxidase sont suivies par les méthodes traditionnelles EM pour la coloration et la déshydratation de l’alcool^33,36. Cependant, il a été démontré que la suite de fixation chimique avec HPF / FS fournit un avantage distinct dans la préservation par rapport à la fixation chimique traditionnelle et la déshydratation de l’alcool seul⁴⁰. La perte d’intégrité ultrastructurale observée dans les échantillons traditionnels de TEM semble moins liée à la fixation qu’à la déshydratation, qui se fait généralement en utilisant de l’alcool à température ambiante ou sur la glace, et peut conduire à l’extraction des lipides et des sucres^40,41. Pour développer la méthode cryoAPEX, nous avons émis l’hypothèse que la fixation chimique et la réaction de peroxidase, suivies par HPF et FS, produiraient un résultat optimal en termes de préservation ultrastructurale.

Ici, nous présentons le protocole cryoAPEX, qui combine apEX2 marquage avec des méthodes de cryofixation et de substitution de gel (Figure 1). Ce protocole simple se compose de la transfection d’une protéine APEX2-étiquetée d’intérêt, de fixation chimique des cellules, et de la réaction de peroxidase. HPF et FS sont ensuite effectués suivis de l’encastrage typique de résine et de la section mince. L’imagerie TEM révèle une excellente préservation de l’ultrastructure à l’aide de cette méthode. En outre, la localisation subcellulaire à haute résolution et la distribution spatiale d’une protéine lumenal de réticulum endoplasmique (ER) ont été observées. Cette méthode est largement utile pour la détection de la localisation des protéines membranaires dans les cellules pour l’analyse de la microscopie électronique. Dans nos mains, la méthode a fonctionné avec succès pour une variété de lignées cellulaires cultivées dans la culture tissulaire, y compris HEK-293T (rein embryonnaire humain), HeLa (cancer du col de l’utérus humain), Cos7 (fibroblaste de rein de singe vert africain), et BHK (rein de hamster bébé). Des instructions détaillées sont décrites ci-dessous à l’aide de cellules HEK-293T.

Protocol

1. Culture cellulaire et transfection Seed HEK-293T cellules sur un 60 mm de diamètre ou plus grand plat de culture tissulaire et de croître à 60%-90% confluence dans un incubateur de culture cellulaire à 37 oC et 5% CO2. Cellules transfect avec plasmides d’expression de mammifères APEX2-marqués utilisant le réactif de transfection (voir tableau des matériaux) selon les directives du fabricant. À 12 à 15 heures après la transfection, laver les cellule…

Representative Results

Afin de comparer la conservation ultrastructurale utilisant la méthode cryoAPEX avec la fixation et la déshydratation traditionnelles, nous avons préparé des échantillons dans lesquels une membrane de réticulum endoplasmique (ERM ; ER membrane) peptide a été marqué avec APEX2 et transfecté dans les cellules HEK-293T. ERM-APEX2 localise à la face cytoplasmique de l’ER et transforme la structure ER en structures morphologiquement distinctes connues sous le nom d’ER lisse organisée (OSER)34…

Discussion

Le protocole cryoAPEX présenté ici fournit une méthode robuste pour caractériser la localisation des protéines membranaires dans l’environnement cellulaire. Non seulement l’utilisation d’une étiquette APEX2 codée génétiquement permet-elle une localisation précise d’une protéine d’intérêt, mais l’utilisation de la cryofixation et de la déshydratation à basse température offre une excellente conservation et la coloration de l’ultrastructure cellulaire environnante. Combinées, ces approches so…

Materials

3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	D5637-1G
Acetone (Glass Distilled)	Electron Microscopy Sciences	10016
Beakers; Plastic, Disposable 120 cc	Electron Microscopy Sciences	60952
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-100G
Cryogenic Storage Vials, 2 mL	VWR	82050-168
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Corning	10-017-CV
Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin	Sigma-Aldrich	44611-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964	Sigma-Aldrich	44612-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060)	Sigma-Aldrich	44613-100ML
Durcupan ACM Fluka,single component D	Sigma-Aldrich	44614-100ML
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm	Electron Microscopy Sciences	70901
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm	Electron Microscopy Sciences	70900
Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement	Corning	355104
Glass Knife Boats, 6.4 mm	Electron Microscopy Sciences	71008
Glass Knifemaker	Leica Microsystems	EM KMR3
Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	16120
HEK 293 Cells	ATCC	CRL-1573
High Pressure Freezer with Rapid Transfer System	Leica Microsystems	EM PACT2	Archived Product Replaced by Leica EM ICE
Hydrogen Peroxide 30% Solution	Fisher Scientific	50-266-27
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	L3000015
Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm	Mager Scientific	16707898
Osmium Tetroxide, crystalline	Electron Microscopy Sciences	19110
Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade	VWR	97062-950
Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm	Mager Scientific	16702738
Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film	Electron Microscopy Sciences	FF2010-Cu
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	102090-962
Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS)	Avantor Macron Fine Chemicals	7708-10
Tannic Acid	Electron Microscopy Sciences	21710
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm	VWR	25382-166
Ultra Glass Knife Strips	Electron Microscopy Sciences	71012
Ultramicrotome	Leica Microsystems	EM UC7
Uranyl Acetate Dihydrate	Electron Microscopy Sciences	22400