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Biologia

초구조적으로 보존된 세포 내 막 단백질 국소화의 전자 현미경 분석을 위한 CryoAPEX 방법

Published: February 27, 2020
doi:
10.3791/60677
, , ,
1Department of Biological Sciences,Purdue University, 2Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology,Purdue University, 3Purdue Institute of Inflammation, Immunology and Infectious Disease,Purdue University, 4Bindley Biosciences Center,Purdue University, 5Purdue Institute of Integrative Neuroscience,Purdue University, 6Purdue Center for Cancer Research,Purdue University

Summary

이 프로토콜은 APEX2 태그가 달린 막 단백질이 최적으로 보존된 세포 초음파 구조 내에서 전송 전자 현미경검사법에 의해 국한될 수 있는 cryoAPEX 방법을 설명합니다.

Abstract

신호 전이 및 막 인신 매매 와 같은 주요 세포 이벤트는 세포 구획 내의 적절한 단백질 위치에 의존합니다. 단백질의 정확한 세포 내 외 현지화를 이해하는 것은 많은 생물학적 질문에 대답하기 위해 이렇게 중요합니다. 적절한 세포 보존 및 염색과 결합된 단백질 국소화를 식별하기 위한 견고한 라벨에 대한 탐구는 역사적으로 어려운 일이었습니다. 전자 현미경 검사법 (EM) 화상 진찰에 있는 최근 어드밴스는 세포 보존을 증가하고 표적 단백질을 표시하기 위하여 많은 방법 그리고 전략의 발달로 이끌어 냈습니다. 비교적 새로운 퍼옥시다아제 기반 유전자 태그인 APEX2는 복제 가능한 EM 활성 태그의 유망한 리더입니다. 투과 전자 현미경 검사법 (TEM)을 위한 견본 준비는 또한 고압 동결 (HPF) 및 저온 탈수 및 동결 치환 (FS)를 통해 염색에 의한 저온화의 출현과 더불어 최근에 진보했습니다. HPF 및 FS는 유리체 샘플의 저온 이미징에 이어 두 번째로 TEM 이미징을 위한 셀룰러 울트라구조의 우수한 보존을 제공합니다. 여기서 우리는 HPF 및 FS와 APEX2 태그의 사용을 결합하는 cryoAPEX 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜에서 관심 있는 단백질은 APEX2로 태그가 지정되고 화학적 고정 및 과산화아제 반응이 뒤따릅니다. 실온에서 전통적인 염색 및 알코올 탈수 대신, 샘플은 저온이며 FS를 통해 저온에서 탈수 및 염색을 겪습니다. cryoAPEX를 사용하면 관심 있는 단백질을 세포외 구획 내에서 식별할 수 있을 뿐만 아니라 구조적으로 보존된 멤브레인 내에서의 토폴로지와 관련하여 추가 정보를 해결할 수 있습니다. 우리는 이 방법이 세포기관 루멘 내의 단백질 분포 패턴을 해독하고, 다른 표지되지 않은 소기관과 가까운 한 소기관 내에서 단백질의 구획화를 구별할 수 있을 만큼 충분히 높은 해상도를 제공할 수 있음을 보여줍니다. 추가, cryoAPEX는 절차적으로 간단 하 고 조직 배양에서 성장 하는 세포에 순종. 일반적인 동결 및 동결 대체 방법보다 기술적으로 더 어렵지 않습니다. CryoAPEX는 유전적으로 태그가 지정될 수 있는 막 단백질의 TEM 분석에 널리 적용됩니다.

Introduction

생물학 연구는 수시로 세포와 세포기관 내의 세포내 단백질 현지화를 해결의 질문을 포함합니다. 면역형광 현미경 검사법은 단백질 국소화의 유용한 저해상도 뷰를 제공하며, 최근 초고해상도 이미징의 발전은 형광태그단백질1,2,3에대한 해상도의 한계를 밀어내고 있다. 그러나, 전자 현미경 검사법 (EM)는 단백질의 표지가 도전이더라도, 고해상도 세포 초음파를 화상 진찰을 위한 금 본위제남아 있습니다.

역사적으로, 몇몇 EM 방법은 초구조 단백질 현지화의 질문에 접근하기 위하여 이용되었습니다. 가장 일반적으로 이용되는 방법 중 하나는 항원 특이적 1 차 항체가 관심있는 단백질을 검출하기 위하여 이용되는 면역전자 현미경 검사법 (IEM)입니다. EM 신호는 전자 조밀 한 입자와 공액 이차 항체의 응용프로그램에 의해 생성되며, 가장 일반적으로 콜로이드 금4,5. 대안적으로, 말무과후옥시다아제(HRP)와 같은 효소와 접합된항체는6, 7,8을전자조밀성 침전물생성에 사용될 수 있다. IEM에는 사전 포함 및 사후 포함 레이블이라고 하는 두 가지 주요 방법이 있습니다. 사전 포함 IEM에서 항체는 세포에 직접 도입되어 세포의 빛 고정 및 투과화가 필요합니다9,10,11. 두 단계 모두초구조12,13을손상시킬 수 있다. 1.4 nm 나노 골드와 공액 된 항체 Fab 단편으로 구성된 상당히 작은 항체의 개발은 매우 부드러운 투과 조건사용 이 가능합니다; 그러나 나노 골드는 TEM에서 직접 시각화하기에는 너무 작으며14,15,16이표시되기 위해 추가 향상 단계가 필요합니다. 임베딩 후 IEM에서 항체는 수지17에고정, 탈수 및 삽입에 의해 완전히 처리 된 세포의 얇은 섹션에 적용됩니다. 이러한 접근법은 투과 단계를 피하지만, 샘플 전처리 전반에 걸쳐 관심의 에피토프를 보존하는 것은18,19,20에도전적이다. 도쿠야스 광 고정 방법 다음에 동결, 저온 절편 및 항체 검출은 향상된 에피토프보존(21,22)을제공한다. 그러나, 극저온 초미세 절제술의 기술적 요구 사항뿐만 아니라 세포에서 달성된 최적대비 이하의 불이익은 23가지단점이다.

유전적으로 인코딩된 태그를 사용하면 관심 있는 단백질의 검출과 관련된 IEM의 많은 어려움을 제거할 수 있습니다. 태그의 다양한 사용할 수 있습니다, HRP를 포함, 페리틴, ReAsH, miniSOG, 및 메탈로티오닌24,25,26,27,28,29,30,31, 32. 이들 각각은 이전 방법에 비해 장점이 있지만, 각각은 또한 광범위한 사용을 방지 단점이 있다. 이러한 단점은 시토솔에서 HRP의 비활성에서 페리틴 태그의 큰 크기, ReAsH의 빛 감도, 작은 크기와 금속 로티오닌의 세포 염색과의 호환성 부족에 이르기까지 다양합니다. 최근에는 아스코르브베이트 과산화아코시다아제로부터 유래된 단백질이 EM 태그로 설계되고 있으며, APEX233,34. 과산화제로서, APEX2는 3,3′ 디아미노벤지딘(DAB)의 산화를 촉매할 수 있으며, 관심 있는 단백질(25 nm 미만)으로부터의 최소한의 확산과 국소 EM 대비를 제공하기 위해 오스뮴 테트록사이드와 반응하는 침전물을 생성한다(33,35. 기존의 HRP 기반 방법과 달리 APEX2는 매우 안정적이며 모든 셀룰러 구획33에서활성 상태로 유지됩니다. 샘플은 기존의 EM 샘플 염색 및 주변구조물(33,34,36)의좋은 시각화를 허용하는 방법을 사용하여 TEM용으로 처리될 수 있다. APEX2는 작은 크기, 안정성 및 다기능성으로 인해 잠재력이 큰 EM 태그로 부상했습니다.

위에서 논의된 많은 접근법은 초구조보존, 저온 동결치환착및저온동결치환착에서 현재의 당과 결합될 수 없거나 아직 결합되지 않았다. 따라서, 그들은 정확한 단백질 국소화를 결정 하기 위해 막 보존 및 세포 염색의 부족에서 고통. 이것은 반드시 얻을 수있는 데이터의 해상도와 해석을 제한합니다. 고압 동결 (HPF)에 의한 Cryofixation은 수성 샘플의 결정화보다는 유리화를 일으키는 고압 (~ 2,100 bar)에서 액체 질소에서 샘플을 신속하게 동결시켜37,38,39에가까운 상태로 세포를 보존합니다. HPF는 동결 치환(FS), 저온(-90°C) 탈수액과 인큐베이션, 오스뮴 테트옥사이드 및 우라닐 아세테이트와 같은 전형적인 EM 얼룩을 결합한다. HPF와 FS는 함께 전통적인 화학 적 고정 (유물로 이어질 수있는 더 이상 과정) 및 실온 또는 얼음 (지질과 설탕의 추출로 이어질 수있는) 알코올 탈수에 비해 뚜렷한 이점을 제공하므로 단백질 검출을위한 최고의 EM 태그와 결합하는 것이 바람직합니다.

HPF/FS가 APEX2 라벨링과 결합되지 않은 한 가지 이유는 빛 화학적 고정이 과산화아역 반응의 전제 조건이며 DAB 반응 생성물의 확산을 제한하기 때문입니다. 지금까지 APEX2 연구에서, 고정 및 과산화아제 반응은 염색 및 알코올 탈수에 대한 전통적인 EM 방법에 이어33,36. 그러나, HPF/FS를 이용한 화학적 고정을 따르는 것은 전통적인 화학적 고정 및 알코올 탈수 단독40에비해 보존에 뚜렷한 이점을 제공한다는 것을 보여주었다. 전통적인 TEM 샘플에서 볼 수 있는 초구조적 무결성의 손실은 탈수에 보다 고정에 덜 연결된 것으로 보이며, 이는 전형적으로 실온 또는 얼음에서 알코올을 사용하여 행해지며, 지질 및 당류의 추출로 이어질 수 있다40,41. cryoAPEX 방법을 개발하기 위해, 우리는 화학 적 고정 및 과산화 아제 반응, HPF 및 FS 에 이어, 초구조 보존의 관점에서 최적의 결과를 생성 할 것이라고 가설.

여기서 우리는 APEX2 태그를 동결 및 동결 대체 방법과 결합한 cryoAPEX프로토콜을제시합니다(그림 1). 이 간단한 프로토콜은 관심 있는 APEX2 태그가 달린 단백질의 형질감염, 세포의 화학적 고정 및 과산화아제 반응으로 구성됩니다. HPF 및 FS는 전형적인 수지 임베딩 및 얇은 단면에 의해 수행됩니다. TEM 이미징은 이 방법을 사용하여 초구조체의 우수한 보존을 보여줍니다. 추가적으로, 고분해능 세포성 면역화 및 벤도아성 망막(ER) 루멘성 단백질의 공간 분포가 관찰되었다. 이 방법은 전자 현미경 분석을 위한 세포 내막 단백질 국소화의 검출을 위해 널리 유용합니다. 우리의 손에, 방법은 HEK-293T (인간 배아 신장), HeLa (인간 자궁 경부암), Cos7 (아프리카 녹색 원숭이 신장 섬유아세포), 및 BHK (아기 햄스터 신장)를 포함하여 조직 배양에서 성장한 다양한 세포주를 위해 성공적으로 일했습니다. HEK-293T 세포를 사용하여 상세한 지침이 아래에 설명되어 있습니다.

Protocol

1. 세포 배양 및 형질감염 종자 HEK-293T 세포는 직경 60 mm 또는 더 큰 조직 배양 접시에 37°C 및 5%CO2에서세포 배양 인큐베이터에서 60%-90% 합류로 성장한다. 형질감염 시약을 사용하여 APEX2 태그가 달린 포유류 발현 플라스미드를 사용한 트랜스펙트 세포(재료 표참조)는 제조사의 지시에 따른다. 12-15 시간 후 형질 감염에서, 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세포를 …

Representative Results

저온아펙스 방법을 이용한 초구조보존을 기존의 고정 및 탈수와 비교하기 위해, 우리는 안구 망막(ERM)이 있는 샘플을 제조하였다. ER 멤브레인) 펩티드를 APEX2로 태그하고 HEK-293T 세포로 형질전환하였다. ERM-APEX2는 ER의 세포질 면을 현지화하고 ER 구조를 조직된 부드러운 ER(OSER)34,42,43으로알려진 형태학적으로 구별되는 구조로 리…

Discussion

여기에 제시된 cryoAPEX 프로토콜은 세포 환경 내에서 막 단백질의 국소화를 특성화하는 강력한 방법을 제공한다. 유전적으로 인코딩된 APEX2 태그를 사용하면 관심 있는 단백질의 정확한 국소화를 제공할 뿐만 아니라, 저온 탈수및 저온 탈수의 사용은 주변 세포 초구조체의 우수한 보존 및 염색을 제공합니다. 결합된, 이 접근은 그것의 세포내 문맥 내의 높은 정밀도로 단백질을 현지화하기 위한 강?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

여기서 설명된 프로토콜은 세포 과학 저널, 132 (6), jcs222315 (2019)48에의한 간행물에서 유래한다. 이 작품은 인디애나 임상 및 번역 과학 연구소에서 건강의 국립 연구소에서 R01GM10092 (S.M.에) 및 AI081077 (R.V.S.) 보조금에 의해 지원됩니다, CTSI-106564 (S.M.에), 그리고 PI4D-209263 (S.M.에) 감염성 질환 연구소에서 감염성 연구소, 감염성 연구소.

Materials

3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate Sigma-Aldrich D5637-1G
Acetone (Glass Distilled) Electron Microscopy Sciences 10016
Beakers; Plastic, Disposable 120 cc Electron Microscopy Sciences 60952
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-100G
Cryogenic Storage Vials, 2 mL VWR 82050-168
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Corning 10-017-CV
Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin Sigma-Aldrich 44611-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964 Sigma-Aldrich 44612-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060) Sigma-Aldrich 44613-100ML
Durcupan ACM Fluka,single component D Sigma-Aldrich 44614-100ML
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm Electron Microscopy Sciences 70901
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm Electron Microscopy Sciences 70900
Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement Corning 355104
Glass Knife Boats, 6.4 mm Electron Microscopy Sciences 71008
Glass Knifemaker Leica Microsystems EM KMR3
Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 16120
HEK 293 Cells ATCC CRL-1573
High Pressure Freezer with Rapid Transfer System Leica Microsystems EM PACT2 Archived Product Replaced by Leica EM ICE
Hydrogen Peroxide 30% Solution Fisher Scientific 50-266-27
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific L3000015
Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm Mager Scientific 16707898
Osmium Tetroxide, crystalline Electron Microscopy Sciences 19110
Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade VWR 97062-950
Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm Mager Scientific 16702738
Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film Electron Microscopy Sciences FF2010-Cu
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4 Electron Microscopy Sciences 102090-962
Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS) Avantor Macron Fine Chemicals 7708-10
Tannic Acid Electron Microscopy Sciences 21710
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm VWR 25382-166
Ultra Glass Knife Strips Electron Microscopy Sciences 71012
Ultramicrotome Leica Microsystems EM UC7
Uranyl Acetate Dihydrate Electron Microscopy Sciences 22400
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Mihelc, E. M., Angel, S., Stahelin, R. V., Mattoo, S. The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells. J. Vis. Exp. (156), e60677, doi:10.3791/60677 (2020).
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