El método CryoAPEX para el análisis de microscopía electrónica de la localización de proteínas de membrana dentro de células ultraestructuralmente conservadas

Summary

Este protocolo describe el método crioAPEX, en el que una proteína de membrana etiquetada con APEX2 puede ser localizada por microscopía electrónica de transmisión dentro de la ultraestructura celular óptimamente conservada.

Abstract

Los eventos celulares clave como la transducción de señales y el tráfico de membranas dependen de la ubicación adecuada de las proteínas dentro de los compartimentos celulares. Entender la localización subcelular precisa de las proteínas es por lo tanto importante para responder a muchas preguntas biológicas. La búsqueda de una etiqueta robusta para identificar la localización de proteínas combinada con la preservación celular adecuada y la tinción ha sido históricamente difícil. Los avances recientes en la microscopía electrónica (EM) han llevado al desarrollo de muchos métodos y estrategias para aumentar la preservación celular y etiquetar las proteínas diana. Una etiqueta genética relativamente nueva basada en peroxidasa, APEX2, es un líder prometedor en etiquetas EM-activas clonables. La preparación de muestras para la microscopía electrónica de transmisión (TEM) también ha avanzado en los últimos años con la llegada de la crioexposición por congelación a alta presión (HPF) y deshidratación y tinción a baja temperatura mediante sustitución por congelación (FS). HPF y FS proporcionan una excelente preservación de la ultraestructura celular para imágenes TEM, solo por sitoma directa de muestras vítreas. Aquí presentamos un protocolo para el método crioAPEX, que combina el uso de la etiqueta APEX2 con HPF y FS. En este protocolo, una proteína de interés se etiqueta con APEX2, seguido de la fijación química y la reacción de peroxidasa. En lugar de la tradicional tinción y deshidratación del alcohol a temperatura ambiente, la muestra se criofija y se somete a deshidratación y tinción a baja temperatura a través de FS. Usando crioAPEX, no sólo se puede identificar una proteína de interés dentro de los compartimentos subcelulares, sino que también se puede resolver información adicional con respecto a su topología dentro de una membrana estructuralmente conservada. Mostramos que este método puede proporcionar una resolución lo suficientemente alta como para descifrar patrones de distribución de proteínas dentro de un lumen de organelo, y para distinguir la compartimentación de una proteína dentro de un orgelle cerca de otros orgánulos sin etiquetar. Además, el crioAPEX es procedimentalmente sencillo y susceptible de células cultivadas en el cultivo de tejidos. No es técnicamente más difícil que los métodos típicos de sustitución de criofixación y congelación. CryoAPEX es ampliamente aplicable para el análisis TEM de cualquier proteína de membrana que pueda ser etiquetada genéticamente.

Introduction

Los estudios biológicos a menudo incluyen preguntas sobre cómo resolver la localización de proteínas subcelulares dentro de las células y orgánulos. La microscopía de inmunofluorescencia proporciona una vista útil de baja resolución de la localización de proteínas, y los avances recientes en imágenes de superresolución están empujando los límites de la resolución de proteínas etiquetadas fluorescentes^1,2,3. Sin embargo, la microscopía electrónica (EM) sigue siendo el estándar de oro para la imagen de la ultraestructura celular de alta resolución, aunque el etiquetado de proteínas es un desafío.

Históricamente, se han utilizado varios métodos EM para abordar cuestiones de localización de proteínas ultraestructurales. Uno de los métodos más utilizados es la microscopía inmunoelectrón (IEM), donde se utilizan anticuerpos primarios específicos de antígeno para detectar la proteína de interés. La señal EM se genera mediante la aplicación de anticuerpos secundarios conjugados con partículas de densidad de electrones, más comúnmente oro coloidal^4,5. Alternativamente, los anticuerpos conjugados con enzimas como la peroxidasa de rábano de caballo (HRP) se pueden utilizar para producir un precipitado denso de electrones^6,7,8. Existen dos enfoques principales para el IEM, denominados etiquetado de preincrustación y post-inserción. En iEM pre-incrustación, los anticuerpos se introducen directamente en las células, lo que requiere la fijación de la luz y la permeabilización de las células^9,10,11. Ambos pasos pueden dañar la ultraestructura^12,13. El desarrollo de anticuerpos significativamente más pequeños consistentes en un fragmento de Fab de anticuerpos conjugado con nanooro de 1,4 nm permite utilizar condiciones de permeabilización muy suaves; sin embargo, el nanooro es demasiado pequeño para la visualización directa bajo TEM y requiere pasos de mejora adicionales para ser visible^14,15,16. En IEM posterior a la incrustación, los anticuerpos se aplican en secciones delgadas de células que han sido completamente procesadas por fijación, deshidratación e incrustación en resina^17. Si bien este enfoque evita el paso de permeabilización, preservar el epítome de interés a lo largo de la preparación de la muestra es un reto^18,19,20. El método Tokuyasu de fijación de la luz seguido de congelación, criosección y detección de anticuerpos proporciona una mejor conservación del epítopo^21,22. Sin embargo, los requisitos técnicos de la crioultramicrotomía, así como el contraste subóptimo alcanzado en la célula, son desventajas²³.

El uso de etiquetas codificadas genéticamente elimina muchas de las dificultades de IEM relacionadas con la detección de la proteína de interés. Una variedad de etiquetas están disponibles, incluyendo HRP, ferritina, ReAsH, miniSOG, y metallotionina^{24,25,26,27,28,29,30,31,32}. Cada uno de ellos tiene ventajas sobre los métodos anteriores, pero cada uno también tiene inconvenientes que impiden el uso generalizado. Estos inconvenientes van desde la inactividad de HRP en el citosol hasta el gran tamaño de la etiqueta de ferritina, la sensibilidad a la luz de ReAsH, y el pequeño tamaño y la falta de compatibilidad con la tinción celular de metalotionina. Recientemente, una proteína derivada de ascorbato peroxidasa ha sido diseñada como una etiqueta EM, llamada APEX2^33,34. Como peroxidasa, APEX2 puede catalizar la oxidación de 3,3′ diaminobenzidina (DAB), produciendo un precipitado que reacciona con tetróxido de osmio para proporcionar contraste LOCAL EM con una difusión mínima de la proteína de interés (menos de 25 nm)^33,35. A diferencia de los métodos tradicionales basados en HRP, APEX2 es extremadamente estable y permanece activo en todos los compartimentos celulares³³. Las muestras se pueden procesar para TEM utilizando la tinción de muestras EM tradicional y métodos que permiten una buena visualización de las estructuras circundantes^33,34,36. Debido a su pequeño tamaño, estabilidad y versatilidad, APEX2 ha surgido como una etiqueta EM con gran potencial.

Muchos de los enfoques mencionados anteriormente no pueden ser o aún no se han combinado con el estado actual de la técnica en la preservación ultraestructural, la criofixación y la sustitución de congelación a baja temperatura. Por lo tanto, sufren de una falta de preservación de la membrana y / o tinción celular para determinar la localización precisa de proteínas. Esto limita necesariamente la resolución e interpretación de los datos que se pueden obtener. La criofixación por congelación a alta presión (HPF) implica la congelación rápida de muestras en nitrógeno líquido a alta presión (2.100 bar), lo que provoca vitrificación en lugar de cristalización de muestras acuosas, preservando así las células en un estado casi nativo^37,38,39. HpF es seguido por la sustitución por congelación (FS), una deshidratación a baja temperatura (-90 oC) en acetona combinada con incubación con manchas EM típicas como tetróxido de osmio y acetato de ursionlo. HpF y FS juntos proporcionan una clara ventaja sobre la fijación química tradicional (un proceso más largo que puede conducir a artefactos) y la deshidratación del alcohol a temperatura ambiente o en hielo (que puede conducir a la extracción de lípidos y azúcares), y por lo tanto son deseables para combinar con las mejores etiquetas EM para la detección de proteínas.

Una razón por la que HPF/FS no se ha combinado con el etiquetado APEX2 es que la fijación química ligera es un requisito previo para la reacción de peroxidasa, limitando la difusión del producto de reacción DAB. En los estudios APEX2 realizados hasta ahora, la fijación y la reacción de peroxidasa son seguidas por los métodos tradicionales EM para la tinción y la deshidratación del alcohol^33,36. Sin embargo, se ha demostrado que la siguiente fijación química con HPF/FS proporciona una clara ventaja en la preservación sobre la fijación química tradicional y la deshidratación de alcohol por sí sola⁴⁰. La pérdida de integridad ultraestructural que se ve en las muestras tradicionales de TEM parece estar menos relacionada con la fijación que con la deshidratación, que normalmente se realiza con alcohol a temperatura ambiente o en hielo, y puede conducir a la extracción de lípidos y azúcares^40,41. Para desarrollar el método crioAPEX, hipotetizaron que la fijación química y la reacción de peroxidasa, seguidas de HPF y FS, producirían un resultado óptimo en términos de preservación ultraestructural.

Aquí presentamos el protocolo cryoAPEX, que combina el etiquetado APEX2 con los métodos de sustitución criofixation y freeze(Figura 1). Este protocolo sencillo consiste en la transfección de una proteína de interés con la etiqueta APEX2, la fijación química de las células y la reacción de la peroxidasa. HpF y FS se realizan seguidos de la incrustación típica de resina y el corte fino. Las imágenes TEM revelan una excelente preservación de la ultraestructura utilizando este método. Además, se observó la localización subcelular de alta resolución y la distribución espacial de una proteína lumenal endoplasmática (ER). Este método es ampliamente útil para la detección de la localización de proteínas de membrana dentro de las células para el análisis de microscopía electrónica. En nuestras manos, el método ha trabajado con éxito para una variedad de líneas celulares cultivadas en el cultivo de tejidos, incluyendo HEK-293T (riñón embrionario humano), HeLa (cáncer cervical humano), Cos7 (fibroblasto renal de mono verde africano), y BHK (riñón de hámster bebé). Las instrucciones detalladas se describen a continuación utilizando células HEK-293T.

Protocol

1. Cultivo celular y transfección Células HEK-293T de semilla en un plato de cultivo de tejido de 60 mm de diámetro o más grande y crecen a entre el 60% y el 90% de confluencia en una incubadora de cultivo celular a 37 oC y 5% de CO2. Células transfect con plásmidos de expresión de mamíferos etiquetados con APEX2 utilizando reactivo de transfección (ver Tabla de Materiales)de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A 12–15 h después de la transfe…

Representative Results

Con el fin de comparar la preservación ultraestructural utilizando el método crioAPEX con la fijación y deshidratación tradicional, preparamos muestras en las que una membrana de retículo endoplasmático (ERM; ER membrane) fue etiquetado con APEX2 y transfectó en células HEK-293T. ERM-APEX2 localiza la cara citoplasmática del ER y remodela la estructura de ER en estructuras morfológicamente distintas conocidas como ER suave organizado (OSER)34,42,</…

Discussion

El protocolo crioAPEX presentado aquí proporciona un método robusto para caracterizar la localización de proteínas de membrana dentro del entorno celular. El uso de una etiqueta APEX2 codificada genéticamente no sólo proporciona una localización precisa de una proteína de interés, sino que el uso de criofixación y deshidratación a baja temperatura proporciona una excelente preservación y tinción de la ultraestructura celular circundante. Combinados, estos enfoques son una poderosa herramienta para localizar …

Materials

3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	D5637-1G
Acetone (Glass Distilled)	Electron Microscopy Sciences	10016
Beakers; Plastic, Disposable 120 cc	Electron Microscopy Sciences	60952
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-100G
Cryogenic Storage Vials, 2 mL	VWR	82050-168
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Corning	10-017-CV
Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin	Sigma-Aldrich	44611-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964	Sigma-Aldrich	44612-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060)	Sigma-Aldrich	44613-100ML
Durcupan ACM Fluka,single component D	Sigma-Aldrich	44614-100ML
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm	Electron Microscopy Sciences	70901
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm	Electron Microscopy Sciences	70900
Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement	Corning	355104
Glass Knife Boats, 6.4 mm	Electron Microscopy Sciences	71008
Glass Knifemaker	Leica Microsystems	EM KMR3
Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	16120
HEK 293 Cells	ATCC	CRL-1573
High Pressure Freezer with Rapid Transfer System	Leica Microsystems	EM PACT2	Archived Product Replaced by Leica EM ICE
Hydrogen Peroxide 30% Solution	Fisher Scientific	50-266-27
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	L3000015
Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm	Mager Scientific	16707898
Osmium Tetroxide, crystalline	Electron Microscopy Sciences	19110
Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade	VWR	97062-950
Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm	Mager Scientific	16702738
Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film	Electron Microscopy Sciences	FF2010-Cu
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	102090-962
Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS)	Avantor Macron Fine Chemicals	7708-10
Tannic Acid	Electron Microscopy Sciences	21710
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm	VWR	25382-166
Ultra Glass Knife Strips	Electron Microscopy Sciences	71012
Ultramicrotome	Leica Microsystems	EM UC7
Uranyl Acetate Dihydrate	Electron Microscopy Sciences	22400