Inguinal Subcutane white Adipose Tissue (ISWAT) Transplantatie Model van Murine Eilandjes
Summary
In dit protocol wordt een methode van murineeilandisolatie en transplantatie in het inguinal onderhuids wit vetweefsel beschreven. Geïsoleerde synogenische murine eilandjes worden getransplanteerd in een murine ontvanger met behulp van een kelder membraan hydrogel. De bloedsuikerspiegel van de ontvangers wordt gecontroleerd en de histologieanalyse van de levensperie-transplantaties wordt uitgevoerd.
Abstract
Alvleeskliereilandje transplantatie is een gevestigde therapeutische behandeling voor type 1 diabetes. De niercapsule is de meest gebruikte site voor eilandjetransplantatie in knaagdiermodellen. De strakke niercapsule beperkt echter de transplantatie van voldoende eilandjes bij grote dieren en mensen. Het inguinal onderhuidse witte vetweefsel (ISWAT), een nieuwe onderhuidse ruimte, bleek een potentieel waardevolle locatie voor eilandjetransplantatie. Deze site heeft een betere bloedtoevoer dan andere onderhuidse ruimtes. Bovendien, de ISWAT herbergt een grotere eilandje massa dan de niercapsule, en transplantatie in het is eenvoudig. Dit manuscript beschrijft de procedure van muiseilandjeisolatie en transplantatie op de ISWAT-site van synogene diabetische muisontvangers. Met behulp van dit protocol, murine pancreaseilandjes werden geïsoleerd door standaard collagenase spijsvertering en een kelder membraan matrix hydrogel werd gebruikt voor de vaststelling van de gezuiverde eilandjes in de ISWAT site. De bloedsuikerspiegel van de ontvangende muizen werden gedurende meer dan 100 dagen gecontroleerd. Eilandjegrafts werden op dag 100 na transplantatie teruggevonden voor histologische analyse. Het protocol voor eilandjestransplantatie op de ISWAT-site die in dit manuscript wordt beschreven, is eenvoudig en effectief.
Introduction
De wereldwijde incidentie en prevalentie van type 1 diabetes mellitus (T1DM) nemen snel toe, volgens de statistische gegevens van de International Diabetes Federation (IDF)1. Eilandjestransplantatie is een van de meest veelbelovende benaderingen voor de behandeling van T1DM4. Aangezien de grote doorbraak in klinische eilandjetransplantatie met behulp van het Edmonton protocol2 werd gemeld, functioneert het overleven van eilandjes bij T1DM-ontvangers na 5 jaar nu ongeveer 50%3.
In het verleden werden verschillende transplantatielocaties onderzocht, zoals de lever, niercapsule, milt, intramusculaire regio, onderhuidse ruimte, beenmerg en een omental zakje voor experimentele eilandjetransplantatie5,6,7. Sommige van de bovenstaande sites zijn getest in klinische instellingen8. Hoewel eilandjetransplantatie in de lever de meest gebruikte methode blijft in klinische toepassing op dit moment9,zijn er verschillende belangrijke problemen aan te pakken bij het gebruik van deze site. Bijvoorbeeld, hoe vroeg verlies van de getransplanteerde eilandjes veroorzaakt door de instant bloed gemedieerde ontstekingsreactie (IBMIR) en slechte oxygenatietoevoer10,11 te verminderen en hoe de eilandjegrafts terug te halen indien nodig, omdat ze diffuus lokaliseren in de lever. De niercapsule kan een ideale plek zijn voor knaagdierontvangers. De strakke niercapsule beperkt echter de transplantatie van voldoende allogene eilandjes bij de mens, hoewel het beter geschikt kan zijn voor eilandje xenotransplantatie als gevolg van de sterk gezuiverde varkenseilandletpreparaten die klinisch worden gebruikt5,12. Daarom is de zoektocht naar een meer geschikte site voor eilandjetransplantatie in volle gang.
De onderhuidse ruimte kan worden gebruikt als een klinisch toepasbare locatie voor eilandjetransplantatie vanwege de toegankelijkheid ervan. De efficiëntie van eilandjetransplantatie in de onderhuidse ruimte is echter extreem laag, waardoor een relatief groot aantal eilandjes nodig is om hyperglykemie te keren13. Onlangs vond een Japans onderzoeksteam de ISWAT, een nieuwe onderhuidse site superieur voor eilandjetransplantatie in een murine model in vergelijking met de lever14. De ISWAT bevat de epigastrische slagader en ader, dus de rijke bloedtoevoer kan zorgen voor het revascularisatie van het levene ent. In dit manuscript stellen we een eenvoudige implantatiemethode voor met behulp van een keldermembraanmatrixhydrogel om synogenische urineeilandjes in de ISWAT te fixeren. Dit protocol blijkt effectief voor eilandjetransplantatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alvleeskliereilandjetransplantatie is een veelbelovende therapie voor de behandeling van T1DM. Het effect van deze therapie wordt beïnvloed door vele factoren en het kiezen van een optimale plaats voor het implanteren van het aantal bezoekers is uiterst belangrijk. De ideale anatomische plaats voor eilandjetransplantatie moet de volgende kenmerken hebben: toegankelijkheid voor eenvoudige transplantatie,biopsie en procedures voor het ophalen van grafts; verminderde complicaties; hoge slagingspercentage van de bloedglucos…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van national key R&D Program of China (2017YFC103704)Special Funds for the Construction of High Level Hospitals in Guangdong Province (2019), Sanming Project of Medicine in Shenzhen (SZSM201412020), Fund for High Level Medische Discipline Bouw van Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021SZXJ2018059), Medisch Scientific Research Foundation van de Chinese provincie Guangdong (A2019218), China Postdoctoral Science Foundation (2018M633218).
Materials
| 0.22 μm Syringe-driven Filter Unit | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 5 mL Pasteur pipette | JingAn Biological, China | J00085 | |
| 5 mL syringe | Szboon, China | 20170829 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 5-0 surgical suture | sh-Jinhuan, China | CR537 | |
| 60 mL syringe | Szboon, China | 20170623 | |
| 75% Ethanol | LIRCON, China | 9180527 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L) | Invitrogen | A21202 | Dilution (1:200) |
| anti-mouse Glucagon antibody | Abcam | ab10988 | Dilution (1:100) |
| anti-mouse insulin antibody | Cell Signaling Technology | 3014s | Dilution (1:100) |
| blunt-pointed perfusion needle | Oloey, China | 005 | 32G, yellow |
| BSA | Meilune, China | MB4219 | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | 8~10 weeks | |
| cell culture dish | BIOFIL, China | TCD000100 | General,Non-treated,87.8 mm diameter |
| centrifuge | Thermo Scientific | ST16R | |
| cephalosporin | Lukang medical, China | 150303 | |
| CMRL-1066 | Sigma-Aldrich | C0422 | |
| Codos Pet Clipper | Szcodos, China | CP-8000 | |
| collagenase Type V | Sigma | C9262 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| D-hank's buffer | Coolaber, China | PM5140-10 | |
| dithizone | Sigma-Aldrich | D5130 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| FBS | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| fluorescein diacetate (FDA) | Thermo Fisher | F1303 | |
| fluorescent microscope | Leica | DMIL | |
| gel-loading pipet tips | Corning | CLS4884 | |
| HBSS | Coolaber, China | PM5150-10 | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology | 14166S | |
| HISTOPAQUE-1077 | Sigma-Aldrich | RNBG0522 | |
| HISTOPAQUE-1119 | Sigma-Aldrich | RNBG0536 | |
| Hydrogel | BD Biosciences | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Iodophor | LIRCON, China | 5190313 | |
| light-tight culture dish | DVS, China | AN-5058548 | self-made, glass dish sprayed with black paint |
| Medical Adhesive Tape | Cofoe, China | K12001 | |
| non-invasive microtweezers | RWD Life Science | F11033-11 and F12016-15 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| ophthalmic scissors | RWD Life Science | S12012-12 and S11001-08 | |
| P/S (penicillin / streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
| pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| STZ (streptozotocin) | Sigma-Aldrich | S0130 | |
| Test Strip | GenUltimate | 100-50 | |
| TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L) | proteintech | SA00007-2 | Dilution (1:200) |
| vascular clamp | RWD Life Science | R31006-04 |
Referências
- Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), 007823 (2012).
- Pathak, V., Pathak, N. M., O’Neill, C. L., Guduric-Fuchs, J., Medina, R. J. Therapies for Type 1 Diabetes: Current Scenario and Future Perspectives. Clinical Medicine Insights: Endocrinology and Diabetes. 12, 1179551419844521 (2019).
- Bottino, R., Knoll, M. F., Knoll, C. A., Bertera, S., Trucco, M. M. The Future of Islet Transplantation Is Now. Frontiers in Medicine (Lausanne). 5, 202 (2018).
- Stokes, R. A., et al. Transplantation sites for human and murine islets. Diabetologia. 60 (10), 1961-1971 (2017).
- van der Windt, D. J., Echeverri, G. J., Ijzermans, J. N., Cooper, D. K. The choice of anatomical site for islet transplantation. Cell Transplantation. 17 (9), 1005-1014 (2008).
- Addison, P., Fatakhova, K., Rodriguez Rilo, H. L. Considerations for an Alternative Site of Islet Cell Transplantation. Journal of Diabetes Science and Technology. , (2019).
- Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. Clinical islet transplantation: is the future finally now. Current Opinion in Organ Transplantation. 23 (4), 428-439 (2018).
- Bellin, M. D., et al. Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants. Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).
- Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 7, 211-223 (2014).
- Smood, B., Bottino, R., Hara, H., Cooper, D. K. C. Is the renal subcapsular space the preferred site for clinical porcine islet xenotransplantation? Review article. International Journal of Surgery and Medicine. 69, 100-107 (2019).
- Luan, N. M., Iwata, H. Long-term allogeneic islet graft survival in prevascularized subcutaneous sites without immunosuppressive treatment. American Journal of Transplantation. 14 (7), 1533-1542 (2014).
- Yasunami, Y., et al. A Novel Subcutaneous Site of Islet Transplantation Superior to the Liver. Transplantation. 102 (6), 945-952 (2018).
- Rajab, A. Islet transplantation: alternative sites. Current Diabetes Reports. 10 (5), 332-337 (2010).
- Ekser, B., Vagefi, P. A. Search for the best site in islet xenotransplantation. International Journal of Surgery and Medicine. 70, 106-107 (2019).
- Lu, Y., et al. A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse. Journal of Visualized Experiments. (143), e57160 (2019).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments. (88), e50374 (2014).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), e2096 (2011).
- Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model. Journal of Visualized Experiments. (135), e57559 (2018).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).
