O objetivo geral deste protocolo é instruir como extrair, manter e dissociar as células murina e microglia do sistema nervoso central, seguidas de infecção com parasitas protozoários.
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Artigo de método
Isolamento concomitante de astrócitos primários e microglia para infecção por parasitas protozoários
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Astrócitos e microglia são as células gliais mais abundantes. São responsáveis pelo apoio fisiológico e manutenção da homeostase no sistema nervoso central (SNC). As evidências crescentes de seu envolvimento no controle de doenças infecciosas justificam o interesse emergente no aprimoramento de metodologias para isolar astrócitos primários e microglia, a fim de avaliar suas respostas às infecções que afetam o SNC. Considerando o impacto da infecção por Trypanosoma cruzi (T. cruzi)e Toxoplasma gondii (T. gondii)no CNS, aqui fornecemos um método para extrair, manter, dissociar e infectar astrócitos de murina e células de microglia com parasitas protozoários. As células extraídas de cortices recém-nascidos são mantidas in vitro por 14 dias com substituição periódica diferencial da mídia. Astrócitos e microglias são obtidos a partir do mesmo protocolo de extração por dissociação mecânica. Após a fenotipagem por citometria de fluxo, as células são infectadas com protozoários parasitas. A taxa de infecção é determinada por microscopia de fluorescência em diferentes pontos de tempo, permitindo assim a avaliação da capacidade diferencial das células gliais para controlar a invasão e a replicação do protozoário. Essas técnicas representam métodos simples, baratos e eficientes para estudar as respostas dos astrócitos e microglia às infecções, abrindo o campo para análises neuroimunologia suplementares.
Introdução
O SNC é composto principalmente por neurônios e células gliais1,2,3. Microglia e astrócitos são as células glia mais abundantes no SNC. Microglia, o macrófago residente, é a célula de glia imunocompetente e fagocítica no CNS3,4, enquanto os astrócitos são responsáveis pela manutenção da homeostase e exercem funções de apoio5.
Apesar de as células gliais serem conhecidas por serem conhecidas por serem responsáveis pelo apoio e proteção dos neurônios6....
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Protocolo
Todos os procedimentos experimentais envolvendo camundongos foram realizados de acordo com a Lei Nacional (11.794/2008) e aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidado e Uso animal (IACUC) da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP).
1. Extração, Manutenção e Dissociação de Células Gliais
NOTA: O número de camundongos utilizados para a extração de células gliais depende da quantidade de células necessárias para realizar os experimentos desejados. Neste protocolo, foram obtidos um total de 2,7 x 107 astrócitos e 4 x 106 microglias de seis camundongos c57BL/6 neonatais. Todos os procedime....
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Resultados
No14º dia, a cultura das células gliais (Figura 1A) sofreu dissociação mecânica. As populações de células isoladas foram analisadas por citometria de fluxo segundo marcadores CD11b, CD45 e GFAP. Observou-se uma pureza de 89,5% para a população astrócida e de 96,6% para a população de microglias (Figura 1B). Após o isolamento, as células foram banhadas em uma placa plana de 96 poços e após 24 h estavam prontas para ser.......
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Discussão
A importância de estudar funções isoladas de células gliais em contextos biológicos distintos vem se expandindo nas últimas duas décadas. Compreender o SNC além dos neurônios ainda é um campo crescente na biologia celular, especialmente infecções ou condições inflamatórias8,9,24. As células gliais são cruciais não apenas para o suporte físico dos neurônios (como era conhecido anteriormente), mas também em muitas outras situações.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para revelar.
Agradecimentos
Agradecemos ao professor Dr. Renato A. Mortara, da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), pelo mAb 2C2 anti-Ssp-4. Este trabalho foi apoiado por bolsas da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, na justiça, na obra). subvenção 2017/25942-0 à K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), bolsa 402100/2016-6 à K.R.B.), Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas (INCTV/CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Código financeiro 001). M.P.A. recebe bolsa do CNPq, A.L.O.P. recebe bolsa da CAPES, e I.S.F e L.Z.M.F.B. recebem bolsa da FAPESP.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 70% de etanol | Dinâ mica Quí mica Contemporâneaâ nea | Cat: 2231 | Esterilizar |
| 75 cm2 Frasco | Corning | Cat: 430720U | Material plástico |
| 96 poços placa de cultura de células | Greiner Cellstar | Cat: 655090 | Cultura de células |
| Cloreto de amônio (NH4Cl) | Dinâ mica Quí mica Contemporâneaâ nea | Cat: C10337.01.AH | Remova o anticorpo anti-GFAP de autofluorescência |
| Abcam | Cat.: ab49874 | Filtro superior de frasco antidoby de imunofluorescência | |
| 0,22 μ mm CA | Corning | Cat: 430513 | Filtro de meio de cultura |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma Aldrich | Cat: A7906 | FACS Preparação do tampão |
| CD11b (FITC) | BD Pharmigen | Cat.: 553310 | Anticorpo de citometria de fluxo |
| CD45 (PE) | Invitrogen | Cat.: 12-0451-83 | Anticorpo de citometria de fluxo |
| Centrífuga | Eppendorf | Cat: 5810R | |
| Centrífuga de | Eppendorf | 5415R | Gabinete de |
| biossegurança de classe II | Pachane | Cat: 200 | Armário de biossegurança para procedimentos estéreis |
| CO2 Incubadora | ThermoScientific | Modelo: 3110 | Manutenção de células primárias |
| Tubos cônicos 15 mL | Corning | Cat: 430766 | Material plástico |
| Tubos cônicos 50 mL | Corning | Cat: 352070 | Material plástico |
| Contador de células automatizado Countess | Invitrogen | Cat: C10281 | Contador de células |
| DAPI | Invitrogen | Cat.: D1306 | Imunofluorescência antidoby |
| Câmera de microscópio digital | Nikon | Cat: DS-RI1 | Capturar imagens no microscópio |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | Cat: 12800-058 | Meio de cultura celular |
| Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) | Sigma Aldrich | Cat: E9884 | FACS Preparação de tampão |
| F12 Mistura de nutrientes | Gibco | Cat: 21700-026 | Meio de cultura celular |
| FACS Canto II | BD Biosciences | Citômetro de fluxo | indisponível |
| Soro bovino fetal (FBS) | LGC Biotecnologia | Cat: 10-bio500-1 | Suplemento de meio de cultura de células |
| Flow Jo (software) | Flow Jo | Versão: Flow Jo_9.9.4 | Análise de dados |
| Luz intensa de fluorescência | Nikon | Cat: C-HGFI | Fonte de fluorescência |
| GFAP (APC) | Invitrogen | Cat.: 50-9892-82 | Anticorpo de citometria de fluxo |
| Cabra - IgG anti-rato (FITC) | Kirkeegood& Perry Lab (KPL) | Cat.: 172-1806 | Imunofluorescência antidoby |
| HBSS - Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | Cat: 14175079 | Meio de cultura de células |
| HEPES | Sigma Aldrich | Cat: H4034 | Suplemento de meio de cultura de células |
| IC Fixation Buffer | Invitrogen | Cat: 00-8222-49 | Fixação de células para Citometria de Fluxo |
| Microscópio invertido | Nikon | Modelo: ECLIPSE TS100 | Microscópio |
| Isoflurano | Cristá lia | Cat: 21.2665 | Anestésico inalado |
| Metanol | Synth | Cat: 01A1085.01.BJ | Fixação para Imunofluorescência |
| Micro espátula | ABC inoxidável | cirúrgico | indisponível |
| Microtubo 1,5 mL | Axygen | Cat: MCT-150-C | Material plástico |
| Anticorpo monoclonal (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 | Não comercial | Não comercial | Imunofluorescência antidoby |
| Pipeta multicanal (p200) | Corning | Cat: 751630124 | Reagentes de pipeta |
| Software NIS Elements Nikon | Versão 4.0 | Adquirir e analisar imagens | |
| Leite desnatado | Nestlé | Cat: 9442405 | Solução de bloqueio para imunofluorescência |
| Incubadora Orbital Shaker | ThermoScientific | Modelo: 481 Cat: 11 | Dissociar micróglia de astrócitos |
| Paraformaldeído (PFA) | Sigma Aldrich | Cat: P6148 | Fixação para Imunofluorescência |
| PBS | Não comercial | Não comercial | Tampão neutro |
| Penicilina G | Sigma Aldrich | Cat: P-7794 | Suplemento de meio de cultura de células |
| Tampão de permeabilização (10x) | Invitrogen | Cat: 00-8333-56 | Permeabilização celular para citometria de fluxo |
| Placa de Petri 60 mm x 15 mm (Descartável, estéril) | Prolab | Cat: 0303-8 Medidor de | de material plástico |
| Kasvi | K39-1014B | Calibrar solução de pH | |
| RPMI 1640 Médio | Gibco | Cat: 31800-014 | Meio de cultura celular |
| Tesoura | ABC inoxidável | Cat: LO9-W4 | Material cirúrgico |
| Pipeta serológica 10 mL | Corning | Cat: 4101 | Material plástico |
| Pipeta serológica 5 mL | Corning | Cat: 4051 | Material plástico |
| Pipeta monocanal (p1000) | Gilson Pipetman | Cat: F123602 | Reagentes de pipeta |
| simples Pipeta de canal (p200) | Gilson Pipetman | Cat: F123601 | Reagentes de pipeta |
| Bicarbonato de sódio | Sigma Aldrich | Cat: S6297 | Suplemento de meio de cultura de |
| células Sal de sulfato de estreptomicina | Sigma Aldrich | Cat: S9137 | Suplemento de meio de cultura de células |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | Cat: T9284 | Permeabilização para imunofluorescência |
| Tripsina | Gibco | Cat: 27250-018 | Pinça de enzima digestiva |
| ABC inoxidável | Cat: L28-P4-172 | Material cirúrgico | |
| Banho-maria | Novatecnica | Modelo: 09020095 | Digerir tecido a 37 ° C com tripsina |
Referências
- Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
- Herculano-Houzel, S.
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Reimpressões e permissões
