Samtidig isolering af primære astrocytter og mikroglia for protozoparasitinfektion
Summary
Det overordnede mål med denne protokol er at instruere, hvordan man udvinder, vedligeholder og dissociere murine astrocyt og mikrogliaceller fra centralnervesystemet, efterfulgt af infektion med protozoparasitter.
Abstract
Astrocytter og mikroglia er de mest rigelige gliaceller. De er ansvarlige for fysiologisk støtte og homøostase vedligeholdelse i centralnervesystemet (CNS). De stigende beviser for deres deltagelse i bekæmpelse af smitsomme sygdomme berettiger den nye interesse i at forbedre metoderne til isolering af primære astrocytter og mikroglia med henblik på at evaluere deres reaktioner på infektioner, der påvirker CNS. I betragtning af virkningen af Trypanosoma cruzi (T. cruzi) og Toxoplasma gondii (T. gondii)infektion i CNS, her giver vi en metode til at udtrække, vedligeholde, dissociere og inficere murine astrocytter og mikroglia celler med protozoa parasitter. Ekstraherede celler fra nyfødte cortices opretholdes in vitro i 14 dage med periodisk differentiale medier udskiftning. Astrocytter og mikroglia fremstilles af samme ekstraktionsprotokol ved mekanisk dissociation. Efter fænomærke ved flow cytometri, celler er inficeret med protozoer parasitter. Infektionsraten bestemmes ved fluorescensmikroskopi på forskellige tidspunkter, hvilket gør det muligt at vurdere gliacellers differentierede evne til at kontrollere protozoinvasion og replikation. Disse teknikker repræsenterer enkle, billige og effektive metoder til at studere svarene fra astrocytter og mikroglia til infektioner, hvilket åbner området for yderligere neuroimmunologi analyse.
Introduction
CNS består hovedsageligt af neuroner og gliaceller1,2,3. Mikroglia og astrocytter er de mest rigelige glia celler i CNS. Microglia, den hjemmehørende makrofag, er immunkompetente og fagocytiske glia celle i CNS3,4,mens astrocytter er ansvarlige for at opretholde homøostase og udøve understøttende funktioner5.
På trods af at gliaceller klassisk er kendt for at være ansvarlige for støtte og beskyttelse af neuroner6,7, er nye funktioner i disse celler blevet beskrevet i den seneste litteratur, herunder deres reaktioner på infektioner8,9,10,11. Således er der et skub til at udvikle metoder til at isolere disse gliaceller til at forstå deres funktioner individuelt.
Der er nogle alternative modeller til at studere gliaceller snarere end primære kulturer, som udødeliggjortcelleslægter og in vivo modeller. Men, udødeliggjorte celler er mere tilbøjelige til at gennemgå genetiske drivende og morfologiske ændringer, mens in vivo undersøgelser pålægge begrænset manipulation betingelser. Omvendt primære kulturer er nemme at håndtere, bedre ligne in vivo celler og også give os mulighed for at kontrollere eksperimentelle faktorer12,13. Her beskriver vi retningslinjer for, hvordan man udvinder, vedligeholder og dissocierer murineastrocytter og primære mikrogliaceller i samme protokol. Desuden giver vi også eksempler på, hvordan man arbejder med protozoinfektion i disse kulturer.
CNS celler udvundet fra neonatal mus (op til 3 dag gamle) blev dyrket i 14 dage på differentiale medier, der tillader præferencevækst af astrocytter og mikroglia celler. Da mikroglia hvile over de vedlagte astrocytter, cellepopulationer blev mekanisk adskilt i en orbital inkubator. Dernæst indsamlede vi alle supernatanten, der indeholder mikroglia og tilføjede trypsin for at frigøre astrocytter. Isolerede gliaceller blev fænotypisk evalueret ved flowcytometri og belagt i henhold til det ønskede eksperiment.
Vi gav også eksempler på, hvordan man inficerer disse isolerede mikroglia og astrocytter med protozoparasitter. T. gondii er en meget neurotropisk protozoer ansvarlig for toxoplasmose14, mens T. cruzjeg er ansvarlig for Chagas sygdom, som kan føre til udvikling af neurologiske lidelser i CNS15,16. Desuden er det også blevet rapporteret, at infektion med T. gondii17,18 eller T. cruzi19,20,21 var den formentlig dødsårsag hos immunkompromitterede patienter. Derfor, belysning af immunologiske rolle gliaceller fra CNS i at kontrollere protozoer infektioner er af stor betydning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Betydningen af at studere isolerede gliaceller funktioner i forskellige biologiske sammenhænge har været stigende i de sidste to årtier. Forståelse af CNS ud neuroner er stadig et voksende område i cellebiologi, især under infektioner eller inflammatoriske tilstande8,9,24. Gliaceller er afgørende ikke kun for neuroner fysisk støtte (som det tidligere var kendt), men også i mange andre fysiologiske situationer såsom neu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke professor Dr. Renato A. Mortara fra Federal University of São Paulo (UNIFESP) for mAb 2C2 anti-Ssp-4. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, tilskud 2017/25942-0 til K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, tilskud 402100/2016-6 til K.R.B.), Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas (INCTV/CNPq) og Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Finanskode 001). M.P.A. modtager stipendium fra CNPq, A.L.O.P. modtager stipendium fra CAPES, og I.S.F og L.Z.M.F.B. modtager stipendium fra FAPESP.
Materials
| 70% Ethanol | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: 2231 | Sterilize |
| 75 cm2 Flask | Corning | Cat: 430720U | Plastic material |
| 96 well cell culture plate | Greiner Cellstar | Cat: 655090 | Cell culture |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: C10337.01.AH | Remove autofluorescence |
| Anti-GFAP antibody | Abcam | Cat.: ab49874 | Immunofluorescence antidoby |
| Bottle Top Filter 0.22 mm CA | Corning | Cat: 430513 | Culture medium filter |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | Cat: A7906 | FACS Buffer preparation |
| CD11b (FITC) | BD Pharmigen | Cat.: 553310 | Flow cytometry antibody |
| CD45 (PE) | Invitrogen | Cat.: 12-0451-83 | Flow cytometry antibody |
| Centrifuge | Eppendorf | Cat: 5810R | Centrifugation |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Centrifugation |
| Class II biosafety cabinet | Pachane | Cat: 200 | Biosafety cabinet for sterile procedures |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Model: 3110 | Primary cells maintenance |
| Conical tubes 15 mL | Corning | Cat: 430766 | Plastic material |
| Conical tubes 50 mL | Corning | Cat: 352070 | Plastic material |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | Cat: C10281 | Cell counter |
| DAPI | Invitrogen | Cat.: D1306 | Immunofluorescence antidoby |
| Digital Microscope Camera | Nikon | Cat: DS-RI1 | Capture images on microscope |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | Cat: 12800-058 | Cell culture medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | Cat: E9884 | FACS Buffer preparation |
| F12 Nutrient Mixture | Gibco | Cat: 21700-026 | Cell culture medium |
| FACS Canto II | BD Biosciences | Unavaiable | Flow cytometer |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | LGC Biotechnology | Cat: 10-bio500-1 | Cell culture medium supplement |
| Flow Jo (software) | Flow Jo | Version: Flow Jo_9.9.4 | Data analysis |
| Fluorescence intenselight | Nikon | Cat: C-HGFI | Fluorescence source |
| GFAP (APC) | Invitrogen | Cat.: 50-9892-82 | Flow cytometry antibody |
| Goat – anti-mouse IgG (FITC) | Kirkeegood&Perry Lab (KPL) | Cat.: 172-1806 | Immunofluorescence antidoby |
| HBSS – Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | Cat: 14175079 | Cell culture medium |
| HEPES | Sigma Aldrich | Cat: H4034 | Cell culture medium supplement |
| IC Fixation Buffer | Invitrogen | Cat: 00-8222-49 | Cell fixation for Flow Citometry |
| Inverted microscope | Nikon | Model: ECLIPSE TS100 | Microscope |
| Isoflurane | Cristália | Cat: 21.2665 | Inhaled anesthetic |
| Methanol | Synth | Cat: 01A1085.01.BJ | Fixation for Immunofluorescence |
| Micro spatula | ABC stainless | Unavaiable | Surgical material |
| Microtube 1.5 mL | Axygen | Cat: MCT-150-C | Plastic material |
| Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 | Non commercial | Non commercial | Immunofluorescence antidoby |
| Multichannel Pipette (p200) | Corning | Cat: 751630124 | Pipette reagents |
| NIS Elements Software | Nikon | Version 4.0 | Acquire and analyse images |
| Non-fat milk | Nestlé | Cat: 9442405 | Blocking solution for immunofluorescence |
| Orbital Shaker Incubator | ThermoScientific | Model: 481 Cat: 11 | Dissociate microglia from astrocytes |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | Cat: P6148 | Fixation for Immunofluorescence |
| PBS | Non commercial | Non commercial | Neutral Buffer |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | Cat: P-7794 | Cell culture medium supplement |
| Permeabilization Buffer (10X) | Invitrogen | Cat: 00-8333-56 | Cell permeabilization for Flow Citometry |
| Petri dish 60×15 mm (Disposable, sterile) | Prolab | Cat: 0303-8 | Plastic material |
| pH meter | Kasvi | K39-1014B | Calibrate pH solution |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | Cat: 31800-014 | Cell culture medium |
| Scissors | ABC stainless | Cat: LO9-W4 | Surgical material |
| Serological pipette 10 mL | Corning | Cat: 4101 | Plastic material |
| Serological pipette 5 mL | Corning | Cat: 4051 | Plastic material |
| Single Channel Pipette (p1000) | Gilson Pipetman | Cat: F123602 | Pipette reagents |
| Single Channel Pipette (p200) | Gilson Pipetman | Cat: F123601 | Pipette reagents |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | Cat: S6297 | Cell culture medium supplement |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma Aldrich | Cat: S9137 | Cell culture medium supplement |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | Cat: T9284 | Permeabilization for immunofluorescence |
| Trypsin | Gibco | Cat: 27250-018 | Digestive enzyme |
| Tweezers | ABC stainless | Cat: L28-P4-172 | Surgical material |
| Water Bath | Novatecnica | Model: 09020095 | Digeste tissue at 37 ºC with trypsin |
Referências
- Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Jäkel, S., Dimou, L. Glial Cells and Their Function in the Adult Brain: A Journey through the History of Their Ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1-17 (2017).
- Streit, W. J. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia. 40 (2), 133-139 (2002).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends in Neuroscience. 32 (12), 638-647 (2009).
- Virchow, R. Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische and pathologische Gewebelehre. Verlag von August Hirschfeld, Berlin. , (1858).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Samartino, C. G., et al. Brucella abortus induces the secretion of proinflammatory mediators from glial cells leading to astrocyte apoptosis. American Journal of Pathology. 176 (3), 1323-1338 (2010).
- Jamilloux, Y., et al. Inflammasome activation restricts Legionella pneumophila replication in primary microglial cells through flagellin detection. Glia. 61 (4), 539-549 (2013).
- Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
- Pacheco, A. L., et al. The impairment in the NLRP3-induced NO secretion renders astrocytes highly permissive to T. cruzi replication. Journal of Leukocyte Biology. 160 (1), 201-207 (2019).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer’s disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
- Lian, H., Roy, E., Zheng, H. Protocol for Primary Microglial Culture Preparation. Bio-Protocol. 6 (21), 1-10 (2016).
- Lüder, C. G. K., Giraldo-Velásquez, M., Sendtner, M., Gross, U. Toxoplasma gondii in primary rat CNS cells: Differential contribution of neurons, astrocytes, and microglial cells for the intracerebral development and stage differentiation. Experimental Parasitology. 92 (1), 23-32 (1999).
- Chagas, C. Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1 (2), (1909).
- Berkowitz, A. L., Raibagkar, P., Pritt, B. S., Mateen, F. J. Neurologic manifestations of the neglected tropical diseases. Journal of Neurological Sciences. 349 (1), 20-32 (2015).
- Jones, J. L., et al. Toxoplasmic encephalitis in HIV-infected persons: risk factors and trends. The Adult/Adolescent Spectrum of Disease Group. AIDS. 10 (12), 1393-1399 (1996).
- Luft, B. J., et al. Toxoplasmic Encephalitis in Patients with the Acquired Immunodeficiency Syndrome. New England Journal of Medicine. 329 (14), 995-1000 (1993).
- Madalosso, G., et al. Chagasic meningoencephalitis: Case report of a recently included AIDS-defining illness in Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 46 (4), 199-202 (2004).
- Rocha, A., et al. Pathology of patients with Chagas’ disease and acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 50 (3), 261-268 (1994).
- Yasukawa, K., et al. Case report: Trypanosoma cruzi meningoencephalitis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (1), 84-85 (2014).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Roederer, M. Compensation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 22 (1), (2002).
- Silva, A. A., et al. Priming astrocytes with TNF enhances their susceptibility to Trypanosoma cruzi infection and creates a self-sustaining inflammatory milieu. Journal of Neuroinflammation. 14 (182), (2017).
- Tsacopoulos, M., Evêquoz-Mercier, V., Perrottet, P., Buchner, E. Honeybee retinal glial cells transform glucose and supply the neurons with metabolic substrate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8727-8731 (1988).
- Nagase, M., Takahashi, Y., Watabe, A. M., Kubo, Y., Kato, F. On-site energy supply at synapses through monocarboxylate transporters maintains excitatory synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2605-2617 (2014).
- Buckman, L. B., Thompson, M. M., Moreno, H. N., Ellacott, K. L. J. Regional astrogliosis in the mouse hypothalamus in response to obesity. Journal of Comparative Neurology. 521 (6), 1322-1333 (2013).
- Vesce, S., Bezzi, P., Volterra, A. The active role of astrocytes in synaptic transmission. Cellular and Molecular Life Sciences. 56 (11-12), 991-1000 (1999).
- Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. The Pathophysiological Role of Microglia in Dynamic Surveillance, Phagocytosis and Structural Remodeling of the Developing CNS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 191 (2017).
- Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
- Sarkar, S., et al. Rapid and refined CD11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility. Journal of Visualized Experiments. (122), e55364 (2017).
- Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (66), e3814 (2012).
