Gelijktijdige isolatie van primaire astrocyten en Microglia voor Protozoa-parasietinfectie
Summary
Het algemene doel van dit protocol is om te instrueren hoe te extraheren, te onderhouden, en scheiden murine astrocyt en microglia cellen uit het centrale zenuwstelsel, gevolgd door infectie met protozoa parasieten.
Abstract
Astrocyten en microglia zijn de meest voorkomende gliacellen. Zij zijn verantwoordelijk voor fysiologische ondersteuning en homeostase onderhoud in het centrale zenuwstelsel (CNS). De toenemende bewijzen van hun betrokkenheid bij de bestrijding van infectieziekten rechtvaardigen de opkomende interesse in de verbetering van methodologieën om primaire astrocyten en microglia te isoleren om hun reacties op infecties die het CNS beïnvloeden te evalueren. Gezien de impact van Trypanosoma cruzi (T. cruzi) en Toxoplasma gondii (T. gondii) infectie in het CNS, hier bieden we een methode om murine astrocyten en microglia-parasieten te extraheren, te onderhouden, te scheiden en te infecteren. Geëxtraheerde cellen uit pasgeboren cortices worden gedurende 14 dagen in vitro onderhouden met periodieke differentiële mediavervanging. Astrocyten en microglia worden verkregen uit hetzelfde extractieprotocol door mechanische dissociatie. Na fenotypering door stromingscytometrie zijn cellen besmet met protozoaparasieten. Het infectiepercentage wordt bepaald door fluorescentiemicroscopie op verschillende tijdspunten, waardoor de evaluatie van het differentieelvermogen van gliacellen om protozoan invasie en replicatie te controleren. Deze technieken vertegenwoordigen eenvoudige, goedkope en efficiënte methoden om de reacties van astrocyten en microglia op infecties te bestuderen, waardoor het veld wordt geopend voor verdere neuroimmunologie-analyse.
Introduction
Het CNS bestaat voornamelijk uit neuronen en gliacellen1,2,3. Microglia en astrocyten zijn de meest voorkomende gliacellen in het CNS. Microglia, de resident macrofaag, is de immunocompetente en de fagocytische glia cel in de CNS3,4, terwijl astrocyten zijn verantwoordelijk voor het behoud van homeostase en oefenen ondersteunende functies5.
Ondanks de klassieke gliacellen die verantwoordelijk zijn voor de ondersteuning en bescherming van neuronen6,7, zijn in de recente literatuur opkomende functies van deze cellen beschreven, inclusief hun reacties op infecties8,9,10,11. Zo is er een push om methoden te ontwikkelen om deze gliacellen te isoleren om hun functies individueel te begrijpen.
Er zijn een aantal alternatieve modellen om gliacellen te bestuderen in plaats van primaire culturen, zoals vereeuwigde cellijnen en in vivo modellen. Vereeuwigde cellen hebben echter meer kans op genetische drifting en morfologische veranderingen, terwijl in vivo studies beperkte manipulatievoorwaarden opleggen. Omgekeerd zijn primaire culturen gemakkelijk te hanteren, lijken we beter op in vivo cellen en stellen ons ook in staat om experimentele factoren12,13te beheersen. Hier beschrijven we richtlijnen voor het extraheren, onderhouden en scheiden van murine-astrocyten en microglia primaire cellen in hetzelfde protocol. Verder geven we ook voorbeelden over hoe te werken met protozoa-infectie in deze culturen.
CNS-cellen geëxtraheerd uit neonatale muizen (tot 3 dagen oud) werden gekweekt voor 14 dagen op differentiële media die de preferentiële groei van astrocyten en microglia cellen mogelijk maakt. Sinds microglia rust boven de bijgevoegde astrocyten, werden de celpopulaties mechanisch gescheiden in een orbitale incubator. Vervolgens verzamelden we alle supernatant met microglia en voegdetrypsine toe om astrocyten los te maken. Geïsoleerde gliacellen werden fenotypisch geëvalueerd door stromingscytometrie en verguld volgens het gewenste experiment.
We hebben ook voorbeelden gegeven over hoe deze geïsoleerde microglia en astrocyten te infecteren met protozoa parasieten. T. gondii is een zeer neurotrope protozoan die verantwoordelijk is voor toxoplasmose14, terwijl T. cruzi verantwoordelijk is voor de ziekte van Chagas die kan leiden tot de ontwikkeling van neurologische aandoeningen in de CNS15,16. Verder is ook gemeld dat infectie met T. gondii17,18 of T. cruzi19,20,,21 de vermoedelijke doodsoorzaak waren bij immuungecompromitteerde patiënten. Daarom is de opheldering van immunologische rol van gliacellen van het CNS bij het beheersen van protozoa-infecties van groot belang.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het belang van het bestuderen van geïsoleerde gliacellen functies in verschillende biologische contexten is uitgebreid in de afgelopen twee decennia. Inzicht in het CNS buiten neuronen is nog steeds een groeiend gebied in de celbiologie, vooral onder infecties of ontstekingsaandoeningen8,9,24. Gliacellen zijn niet alleen cruciaal voor de fysieke ondersteuning van neuronen (zoals voorheen bekend), maar ook in vele andere fysiolo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen professor Dr. Renato A. Mortara van de Federale Universiteit van São Paulo (UNIFESP) bedanken voor mAb 2C2 anti-Ssp-4. Dit werk werd ondersteund door subsidies van Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, subsidie 2017/25942-0 aan K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, subsidie 402100/2016-6 aan K.R.B.), Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas (INCTV/CNPq) en Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Finance Code 001). M.P.A. ontvangt beurs van CNPq, A.L.O.P. ontvangt beurs van CAPES, en I.S.F en L.Z.M.F.B. ontvangt beurs van FAPESP.
Materials
| 70% Ethanol | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: 2231 | Sterilize |
| 75 cm2 Flask | Corning | Cat: 430720U | Plastic material |
| 96 well cell culture plate | Greiner Cellstar | Cat: 655090 | Cell culture |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: C10337.01.AH | Remove autofluorescence |
| Anti-GFAP antibody | Abcam | Cat.: ab49874 | Immunofluorescence antidoby |
| Bottle Top Filter 0.22 mm CA | Corning | Cat: 430513 | Culture medium filter |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | Cat: A7906 | FACS Buffer preparation |
| CD11b (FITC) | BD Pharmigen | Cat.: 553310 | Flow cytometry antibody |
| CD45 (PE) | Invitrogen | Cat.: 12-0451-83 | Flow cytometry antibody |
| Centrifuge | Eppendorf | Cat: 5810R | Centrifugation |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Centrifugation |
| Class II biosafety cabinet | Pachane | Cat: 200 | Biosafety cabinet for sterile procedures |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Model: 3110 | Primary cells maintenance |
| Conical tubes 15 mL | Corning | Cat: 430766 | Plastic material |
| Conical tubes 50 mL | Corning | Cat: 352070 | Plastic material |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | Cat: C10281 | Cell counter |
| DAPI | Invitrogen | Cat.: D1306 | Immunofluorescence antidoby |
| Digital Microscope Camera | Nikon | Cat: DS-RI1 | Capture images on microscope |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | Cat: 12800-058 | Cell culture medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | Cat: E9884 | FACS Buffer preparation |
| F12 Nutrient Mixture | Gibco | Cat: 21700-026 | Cell culture medium |
| FACS Canto II | BD Biosciences | Unavaiable | Flow cytometer |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | LGC Biotechnology | Cat: 10-bio500-1 | Cell culture medium supplement |
| Flow Jo (software) | Flow Jo | Version: Flow Jo_9.9.4 | Data analysis |
| Fluorescence intenselight | Nikon | Cat: C-HGFI | Fluorescence source |
| GFAP (APC) | Invitrogen | Cat.: 50-9892-82 | Flow cytometry antibody |
| Goat – anti-mouse IgG (FITC) | Kirkeegood&Perry Lab (KPL) | Cat.: 172-1806 | Immunofluorescence antidoby |
| HBSS – Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | Cat: 14175079 | Cell culture medium |
| HEPES | Sigma Aldrich | Cat: H4034 | Cell culture medium supplement |
| IC Fixation Buffer | Invitrogen | Cat: 00-8222-49 | Cell fixation for Flow Citometry |
| Inverted microscope | Nikon | Model: ECLIPSE TS100 | Microscope |
| Isoflurane | Cristália | Cat: 21.2665 | Inhaled anesthetic |
| Methanol | Synth | Cat: 01A1085.01.BJ | Fixation for Immunofluorescence |
| Micro spatula | ABC stainless | Unavaiable | Surgical material |
| Microtube 1.5 mL | Axygen | Cat: MCT-150-C | Plastic material |
| Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 | Non commercial | Non commercial | Immunofluorescence antidoby |
| Multichannel Pipette (p200) | Corning | Cat: 751630124 | Pipette reagents |
| NIS Elements Software | Nikon | Version 4.0 | Acquire and analyse images |
| Non-fat milk | Nestlé | Cat: 9442405 | Blocking solution for immunofluorescence |
| Orbital Shaker Incubator | ThermoScientific | Model: 481 Cat: 11 | Dissociate microglia from astrocytes |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | Cat: P6148 | Fixation for Immunofluorescence |
| PBS | Non commercial | Non commercial | Neutral Buffer |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | Cat: P-7794 | Cell culture medium supplement |
| Permeabilization Buffer (10X) | Invitrogen | Cat: 00-8333-56 | Cell permeabilization for Flow Citometry |
| Petri dish 60×15 mm (Disposable, sterile) | Prolab | Cat: 0303-8 | Plastic material |
| pH meter | Kasvi | K39-1014B | Calibrate pH solution |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | Cat: 31800-014 | Cell culture medium |
| Scissors | ABC stainless | Cat: LO9-W4 | Surgical material |
| Serological pipette 10 mL | Corning | Cat: 4101 | Plastic material |
| Serological pipette 5 mL | Corning | Cat: 4051 | Plastic material |
| Single Channel Pipette (p1000) | Gilson Pipetman | Cat: F123602 | Pipette reagents |
| Single Channel Pipette (p200) | Gilson Pipetman | Cat: F123601 | Pipette reagents |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | Cat: S6297 | Cell culture medium supplement |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma Aldrich | Cat: S9137 | Cell culture medium supplement |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | Cat: T9284 | Permeabilization for immunofluorescence |
| Trypsin | Gibco | Cat: 27250-018 | Digestive enzyme |
| Tweezers | ABC stainless | Cat: L28-P4-172 | Surgical material |
| Water Bath | Novatecnica | Model: 09020095 | Digeste tissue at 37 ºC with trypsin |
Referências
- Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Jäkel, S., Dimou, L. Glial Cells and Their Function in the Adult Brain: A Journey through the History of Their Ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1-17 (2017).
- Streit, W. J. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia. 40 (2), 133-139 (2002).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends in Neuroscience. 32 (12), 638-647 (2009).
- Virchow, R. Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische and pathologische Gewebelehre. Verlag von August Hirschfeld, Berlin. , (1858).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Samartino, C. G., et al. Brucella abortus induces the secretion of proinflammatory mediators from glial cells leading to astrocyte apoptosis. American Journal of Pathology. 176 (3), 1323-1338 (2010).
- Jamilloux, Y., et al. Inflammasome activation restricts Legionella pneumophila replication in primary microglial cells through flagellin detection. Glia. 61 (4), 539-549 (2013).
- Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
- Pacheco, A. L., et al. The impairment in the NLRP3-induced NO secretion renders astrocytes highly permissive to T. cruzi replication. Journal of Leukocyte Biology. 160 (1), 201-207 (2019).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer’s disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
- Lian, H., Roy, E., Zheng, H. Protocol for Primary Microglial Culture Preparation. Bio-Protocol. 6 (21), 1-10 (2016).
- Lüder, C. G. K., Giraldo-Velásquez, M., Sendtner, M., Gross, U. Toxoplasma gondii in primary rat CNS cells: Differential contribution of neurons, astrocytes, and microglial cells for the intracerebral development and stage differentiation. Experimental Parasitology. 92 (1), 23-32 (1999).
- Chagas, C. Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1 (2), (1909).
- Berkowitz, A. L., Raibagkar, P., Pritt, B. S., Mateen, F. J. Neurologic manifestations of the neglected tropical diseases. Journal of Neurological Sciences. 349 (1), 20-32 (2015).
- Jones, J. L., et al. Toxoplasmic encephalitis in HIV-infected persons: risk factors and trends. The Adult/Adolescent Spectrum of Disease Group. AIDS. 10 (12), 1393-1399 (1996).
- Luft, B. J., et al. Toxoplasmic Encephalitis in Patients with the Acquired Immunodeficiency Syndrome. New England Journal of Medicine. 329 (14), 995-1000 (1993).
- Madalosso, G., et al. Chagasic meningoencephalitis: Case report of a recently included AIDS-defining illness in Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 46 (4), 199-202 (2004).
- Rocha, A., et al. Pathology of patients with Chagas’ disease and acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 50 (3), 261-268 (1994).
- Yasukawa, K., et al. Case report: Trypanosoma cruzi meningoencephalitis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (1), 84-85 (2014).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Roederer, M. Compensation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 22 (1), (2002).
- Silva, A. A., et al. Priming astrocytes with TNF enhances their susceptibility to Trypanosoma cruzi infection and creates a self-sustaining inflammatory milieu. Journal of Neuroinflammation. 14 (182), (2017).
- Tsacopoulos, M., Evêquoz-Mercier, V., Perrottet, P., Buchner, E. Honeybee retinal glial cells transform glucose and supply the neurons with metabolic substrate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8727-8731 (1988).
- Nagase, M., Takahashi, Y., Watabe, A. M., Kubo, Y., Kato, F. On-site energy supply at synapses through monocarboxylate transporters maintains excitatory synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2605-2617 (2014).
- Buckman, L. B., Thompson, M. M., Moreno, H. N., Ellacott, K. L. J. Regional astrogliosis in the mouse hypothalamus in response to obesity. Journal of Comparative Neurology. 521 (6), 1322-1333 (2013).
- Vesce, S., Bezzi, P., Volterra, A. The active role of astrocytes in synaptic transmission. Cellular and Molecular Life Sciences. 56 (11-12), 991-1000 (1999).
- Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. The Pathophysiological Role of Microglia in Dynamic Surveillance, Phagocytosis and Structural Remodeling of the Developing CNS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 191 (2017).
- Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
- Sarkar, S., et al. Rapid and refined CD11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility. Journal of Visualized Experiments. (122), e55364 (2017).
- Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (66), e3814 (2012).
