원생 동물 기생충 감염에 대 한 기본 성상 세포와 Microglia의 수반되는 격리
Summary
이 프로토콜의 전반적인 목표는 중추 신경계에서 뮤린 성상 세포와 미세 글리아 세포를 추출, 유지 및 해리하는 방법을 지시하고 원생 동물 기생충에 감염하는 것입니다.
Abstract
성상 세포와 미세 글리아는 가장 풍부한 신경교 세포입니다. 그들은 중추 신경계 (CNS)의 생리 적 지원 및 항상성 유지 보수에 대한 책임이 있습니다. 전염병의 통제에 있는 그들의 관여의 증가 기록은 CNS에 영향을 미치는 감염에 그들의 반응을 평가하기 위하여 1 차적인 성상 세포 및 microglia를 격리하는 방법론의 개선에 있는 새로운 관심을 정당화합니다. 트리파노소마 크루지(T. cruzi)와 톡소플라즈마 곤디(T. gondii) 감염의 영향을 고려하여, 여기서 우리는 원생동물 기생충으로 뮤린 천상세포 및 미세글리아 세포를 추출, 유지, 해리 및 감염시키는 방법을 제공한다.T. gondii 신생아 피신자에서 추출 된 세포는 주기적인 차동 매체 교체와 함께 14 일 동안 시험관 내에서 유지됩니다. 성상 세포 및 미세 글리아는 기계적 해리에 의해 동일한 추출 프로토콜로부터 수득된다. 유세포분석으로 자형질이 나는 후, 세포는 원생동물 기생충에 감염된다. 감염율은 다른 시점에서 형광 현미경 검사법에 의해 결정되므로 원생 동물 침입 및 복제를 제어하는 신경교 세포의 차동 능력의 평가가 가능합니다. 이 기술은 감염에 성상 세포와 microglia의 반응을 공부하는 간단하고 저렴하고 효율적인 방법을 나타냅니다, 추가 신경 면역학 분석을위한 필드를 열어.
Introduction
CNS는 주로 뉴런및신경교세포1,,2,,3으로구성된다. 미세글리아 및 성상 세포는 CNS에서 가장 풍부한 신경교 세포입니다. 상체세포가 항상성을 유지하고 지지 기능을 발휘하는 동안, 마이크로글리아는, 상체 세포가 항상성을 유지하고 지지하는 기능을 발휘하는 동안, CNS3,,4에서면역적격 및 식세포 신경세포이다.5
신경교 세포에도 불구하고 고전적으로 뉴런의 지지 및 보호를 담당하는 것으로 알려져 있음에도불구하고,,7,이들 세포의 새로운 기능은 감염에 대한 그들의 반응을 포함하는 최근 문헌에서 기술되고 있다8,,9,,10,,11. 따라서, 개별적으로 그들의 기능을 이해 하기 위해 이러한 신경 교 세포를 격리 하는 방법을 개발 하는 푸시가 있다.
불멸세포계및 생체내 모델과 같은 1차 배양보다는 신경교세포를 연구하는 몇 가지 대체 모델이 있습니다. 그러나, 불멸의 세포는 생체 내 연구에서 제한된 조작 조건을 부과하는 동안, 유전 표류 및 형태학적 변화를 겪을 가능성이 더 높습니다. 반대로, 1차 배양은 다루기 쉽고, 생체내 세포와 더 잘 닮으며, 또한 우리가 실험인자12,,13을조절할 수 있게 한다. 여기에서, 우리는 동일한 프로토콜에 있는 뮤린 성상 세포 및 microglia 1 차적인 세포를 추출, 유지 및 해리하는 방법에 대한 지침을 기술합니다. 또한, 우리는 또한 이 문화에서 원생 동물 감염으로 작동하는 방법에 대한 예를 제공합니다.
신생아 마우스로부터 추출된 CNS 세포(최대 3일 령)는 성상세포 및 미세글리아 세포의 우대성장을 허용하는 차동 배지상에서 14일 동안 배양하였다. microglia는 부착된 성상 세포 위에 있기 때문에, 세포 집단은 궤도 인큐베이터에서 기계적으로 해리되었다. 다음으로, 우리는 마이크로글리아를 함유하는 모든 상상체를 수집하고 성상 세포체를 분리하기 위해 트립신을 첨가했습니다. 단리된 신경교 세포는 유세포측정에 의해 전형적으로 평가되었고 원하는 실험에 따라 도금하였다.
우리는 또한 원생 동물 기생충으로 이 고립된 microglia 및 성상 세포를 감염하는 방법에 대한 예를 제공했습니다. T. gondii는 톡소플라즈마증14를담당하는 고도로 신경성 원생동물이며, T. 크루즈i는 CNS15,,16에서신경 장애의 발달로 이어질 수 있는 샤가스 질환에 대한 책임이 있다. 더욱이, 또한 T. 곤디17,17,18 또는 T. cruzi19,20,,,21에 의한 감염이 면역손상 환자에서 사망의 추정된 원인이었다는 보고가 있다. 따라서 원생동물 감염을 조절하는 과정에서 CNS로부터 신경교 세포의 면역학적 역할의 해명이 매우 중요하다.
Protocol
마우스를 관련시키는 모든 실험 절차는 브라질 국가 법에 따라 수행되었다 (11.794/2008) 상파울루 연방 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인 (UNIFESP). 1. 신경교 세포 추출, 유지 보수 및 해리 참고: 신경교 세포 추출에 사용되는 마우스의 수는 원하는 실험을 수행하는 데 필요한 세포의 양에 따라 달라집니다. 이 프로토콜에서, 총 2.7 x 107…
Representative Results
14일째에, 신경교세포 배양(도1A)은기계적 해리를 겪었다. 단리된 세포 집단은 CD11b, CD45 및 GFAP 마커에 따라 유세포측정에 의해 분석되었다. 성상 세포 집단에 대한 89.5 %의 순도를 관찰 할 수 있었고 미세 글리아 인구에 대한 96.6 %를 관찰 할 수 있었습니다(그림 1B). 격리 후, 세포는 96웰 플랫 플레이트에 도금되었고 24시?…
Discussion
뚜렷한 생물학적 맥락에서 분리된 신경교 세포 기능을 연구하는 것의 중요성은 지난 2년간 확대되고 있습니다. 뉴런을 넘어 CNS를 이해하는 것은 여전히 세포 생물학에서 성장 분야, 특히 감염 또는 염증 조건 하에서8,,9,,24. 신경교세포는 뉴런 의 물리적 지원(이전에 알려진 바와 같이)뿐만 아니라 뉴런 에너지 공급, 신경대사, ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 mAb 2C2 안티 Ssp-4에 대한 상파울루 연방 대학 (UNIFESP)에서 교수 레나토 A. Mortara에게 감사드립니다. 이 작품은 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, Grant 2017/25942-0 to K.R.B.), 콘셀호 나시오날 데센볼비멘토 Científico e Tecnológico (CNPq, 부여 402100/2016-6 에 K.R.B.), 인스티투토 나시오날 드 시엔시아 e 테크놀로지아 드 바시나스 (INCTV/CNPq) 및 쿠르데나카오 드 아페르페이소아멘토 드 페소알 드 니벨 슈페리어 (CAPES, 금융 코드 001). M.P.A.는 CNPq로부터 펠로우십을 받고, A.L.O.P.는 CAPES로부터 펠로우십을 받고, I.S.F와 L.Z.M.F.B.는 FAPESP로부터 펠로우십을 받는다.
Materials
| 70% Ethanol | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: 2231 | Sterilize |
| 75 cm2 Flask | Corning | Cat: 430720U | Plastic material |
| 96 well cell culture plate | Greiner Cellstar | Cat: 655090 | Cell culture |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: C10337.01.AH | Remove autofluorescence |
| Anti-GFAP antibody | Abcam | Cat.: ab49874 | Immunofluorescence antidoby |
| Bottle Top Filter 0.22 mm CA | Corning | Cat: 430513 | Culture medium filter |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | Cat: A7906 | FACS Buffer preparation |
| CD11b (FITC) | BD Pharmigen | Cat.: 553310 | Flow cytometry antibody |
| CD45 (PE) | Invitrogen | Cat.: 12-0451-83 | Flow cytometry antibody |
| Centrifuge | Eppendorf | Cat: 5810R | Centrifugation |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Centrifugation |
| Class II biosafety cabinet | Pachane | Cat: 200 | Biosafety cabinet for sterile procedures |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Model: 3110 | Primary cells maintenance |
| Conical tubes 15 mL | Corning | Cat: 430766 | Plastic material |
| Conical tubes 50 mL | Corning | Cat: 352070 | Plastic material |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | Cat: C10281 | Cell counter |
| DAPI | Invitrogen | Cat.: D1306 | Immunofluorescence antidoby |
| Digital Microscope Camera | Nikon | Cat: DS-RI1 | Capture images on microscope |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | Cat: 12800-058 | Cell culture medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | Cat: E9884 | FACS Buffer preparation |
| F12 Nutrient Mixture | Gibco | Cat: 21700-026 | Cell culture medium |
| FACS Canto II | BD Biosciences | Unavaiable | Flow cytometer |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | LGC Biotechnology | Cat: 10-bio500-1 | Cell culture medium supplement |
| Flow Jo (software) | Flow Jo | Version: Flow Jo_9.9.4 | Data analysis |
| Fluorescence intenselight | Nikon | Cat: C-HGFI | Fluorescence source |
| GFAP (APC) | Invitrogen | Cat.: 50-9892-82 | Flow cytometry antibody |
| Goat – anti-mouse IgG (FITC) | Kirkeegood&Perry Lab (KPL) | Cat.: 172-1806 | Immunofluorescence antidoby |
| HBSS – Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | Cat: 14175079 | Cell culture medium |
| HEPES | Sigma Aldrich | Cat: H4034 | Cell culture medium supplement |
| IC Fixation Buffer | Invitrogen | Cat: 00-8222-49 | Cell fixation for Flow Citometry |
| Inverted microscope | Nikon | Model: ECLIPSE TS100 | Microscope |
| Isoflurane | Cristália | Cat: 21.2665 | Inhaled anesthetic |
| Methanol | Synth | Cat: 01A1085.01.BJ | Fixation for Immunofluorescence |
| Micro spatula | ABC stainless | Unavaiable | Surgical material |
| Microtube 1.5 mL | Axygen | Cat: MCT-150-C | Plastic material |
| Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 | Non commercial | Non commercial | Immunofluorescence antidoby |
| Multichannel Pipette (p200) | Corning | Cat: 751630124 | Pipette reagents |
| NIS Elements Software | Nikon | Version 4.0 | Acquire and analyse images |
| Non-fat milk | Nestlé | Cat: 9442405 | Blocking solution for immunofluorescence |
| Orbital Shaker Incubator | ThermoScientific | Model: 481 Cat: 11 | Dissociate microglia from astrocytes |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | Cat: P6148 | Fixation for Immunofluorescence |
| PBS | Non commercial | Non commercial | Neutral Buffer |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | Cat: P-7794 | Cell culture medium supplement |
| Permeabilization Buffer (10X) | Invitrogen | Cat: 00-8333-56 | Cell permeabilization for Flow Citometry |
| Petri dish 60×15 mm (Disposable, sterile) | Prolab | Cat: 0303-8 | Plastic material |
| pH meter | Kasvi | K39-1014B | Calibrate pH solution |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | Cat: 31800-014 | Cell culture medium |
| Scissors | ABC stainless | Cat: LO9-W4 | Surgical material |
| Serological pipette 10 mL | Corning | Cat: 4101 | Plastic material |
| Serological pipette 5 mL | Corning | Cat: 4051 | Plastic material |
| Single Channel Pipette (p1000) | Gilson Pipetman | Cat: F123602 | Pipette reagents |
| Single Channel Pipette (p200) | Gilson Pipetman | Cat: F123601 | Pipette reagents |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | Cat: S6297 | Cell culture medium supplement |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma Aldrich | Cat: S9137 | Cell culture medium supplement |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | Cat: T9284 | Permeabilization for immunofluorescence |
| Trypsin | Gibco | Cat: 27250-018 | Digestive enzyme |
| Tweezers | ABC stainless | Cat: L28-P4-172 | Surgical material |
| Water Bath | Novatecnica | Model: 09020095 | Digeste tissue at 37 ºC with trypsin |
Referências
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Citar este artigo
Pacheco, A. d. O. L., Amaral, M. P., de Farias, I. S., Bottino, L. Z. M. F., Bortoluci, K. R. Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection. J. Vis. Exp. (157), e60680, doi:10.3791/60680 (2020).