Samtidig isolering av primære astrocytter og microglia for protozoparasittinfeksjon
Summary
Det overordnede målet med denne protokollen er å instruere hvordan man trekker ut, opprettholder og dissosierer murineastrocyte og microglia celler fra sentralnervesystemet, etterfulgt av infeksjon med protozoa parasitter.
Abstract
Astrocytter og mikroglia er de mest tallrike glialcene. De er ansvarlige for fysiologisk støtte og homeostase vedlikehold i sentralnervesystemet (CNS). De økende bevisene for deres engasjement i kontroll av smittsomme sykdommer rettferdiggjør den nye interessen for forbedring av metoder for å isolere primære astrocytter og mikroglia for å evaluere deres respons på infeksjoner som påvirker CNS. Tatt i betraktning virkningen av Trypanosoma cruzi (T. cruzi) og Toxoplasma gondii (T. gondii) infeksjon i CNS, her gir vi en metode for å trekke ut, opprettholde, dissosiere og infisere murine astrocytes og microglia celler med protozoa parasitter. Ekstraherte celler fra nyfødte kortices opprettholdes in vitro i 14 dager med periodisk differensial media erstatning. Astrocytter og mikroglia er hentet fra samme ekstraksjonsprotokoll ved mekanisk dissosiasjon. Etter fenotyping ved flyt cytometri, er celler smittet med protozoer parasitter. Infeksjonsraten bestemmes av fluorescensmikroskopi på forskjellige tidspunkter, slik at evalueringen av differensialevne av glialceller for å kontrollere protozosk invasjon og replikering. Disse teknikkene representerer enkle, billige og effektive metoder for å studere svarene fra astrocytter og mikroglia til infeksjoner, og åpner feltet for videre nevroimmunologianalyse.
Introduction
CNS består hovedsakelig av nevroner og glialceller1,,2,3. Microglia og astrocytter er de mest tallrike gliacellene i CNS. Microglia, bosatt makrofag, er immunokompetent og fagocytisk glia celle i CNS3,4, mens astrocytter er ansvarlig for å opprettholde homeostase og utøve støttende funksjoner5.
Til tross for glial celler blir klassisk kjent for å være ansvarlig for støtte og beskyttelse av nevroner6,7, nye funksjoner av disse cellene har blitt beskrevet i den siste litteraturen, inkludert deres svar på infeksjoner8,9,10,11. Dermed er det et press for å utvikle metoder for å isolere disse glialcene for å forstå sine funksjoner individuelt.
Det er noen alternative modeller for å studere glialceller i stedet for primære kulturer, som udødeliggjorte cellelinjer og in vivo-modeller. Imidlertid er udødelige celler mer sannsynlig å gjennomgå genetiskdrivende og morfologiske endringer, mens in vivo studier pålegge begrensede manipulasjonforhold. Omvendt er primære kulturer enkle å håndtere, ligner bedre på vivo-celler og tillater oss også å kontrollere eksperimentelle faktorer12,13. Her beskriver vi retningslinjer for hvordan du trekker ut, vedlikeholder og dissosierer murineastrocytter og mikroglia primære celler i samme protokoll. Videre gir vi også eksempler på hvordan man arbeider med protozoinfeksjon i disse kulturene.
CNS-celler hentet fra nyfødte mus (opptil 3 dager gamle) ble dyrket i 14 dager på differensialmedier som gjør det mulig å fortrinnsrett vekst av astrocytter og mikrogliaceller. Siden microglia hviler over de vedlagte astrocytter, ble cellepopulasjoner mekanisk dissosiert i en orbital inkubator. Deretter samlet vi alle supernatantsominneholder microglia og lagt trypsin å løsne astrocytter. Isolerte glialceller ble fenotypisk evaluert av flow cytometri og belagt i henhold til ønsket eksperiment.
Vi ga også eksempler på hvordan man infiserer disse isolerte mikroglia og astrocytter med protozoaparasitter. T. gondii er en svært nevrotropisk protozoansvarlig ansvarlig for toksoplasmose14, mens T. cruzjeg er ansvarlig for Chagas sykdom som kan føre til utvikling av nevrologiske lidelser i CNS15,16. Videre har det også blitt rapportert at infeksjon med T. gondii17,18 eller T. cruzi19,20,21 var den antatte dødsårsaken hos immunkompromitterte pasienter. Derfor er oppklaringen av immunologiske rolle glialceller fra CNS i å kontrollere protozoer infeksjoner av stor betydning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Viktigheten av å studere isolerte glialceller fungerer i forskjellige biologiske sammenhenger har ekspandert de siste to tiårene. Forstå CNS utover nevroner er fortsatt et voksende felt i cellebiologi, spesielt under infeksjoner eller inflammatoriske forhold8,9,24. Glialceller er avgjørende ikke bare for nevroner fysisk støtte (som det tidligere var kjent), men også i mange andre fysiologiske situasjoner som nevron energif…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke professor Dr. Renato A. Mortara fra Federal University of São Paulo (UNIFESP) for mAb 2C2 anti-Ssp-4. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, stipend 2017/25942-0 til K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, gi 402100/2016-6 til K.R.B.), Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas (INCTV/CNPq) og Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Finance Code 001). M.P.A. mottar fellesskap fra CNPq, A.L.O.P. mottar fellesskap fra CAPES, og I.S.F og L.Z.M.F.B. mottar fellesskap fra FAPESP.
Materials
| 70% Ethanol | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: 2231 | Sterilize |
| 75 cm2 Flask | Corning | Cat: 430720U | Plastic material |
| 96 well cell culture plate | Greiner Cellstar | Cat: 655090 | Cell culture |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: C10337.01.AH | Remove autofluorescence |
| Anti-GFAP antibody | Abcam | Cat.: ab49874 | Immunofluorescence antidoby |
| Bottle Top Filter 0.22 mm CA | Corning | Cat: 430513 | Culture medium filter |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | Cat: A7906 | FACS Buffer preparation |
| CD11b (FITC) | BD Pharmigen | Cat.: 553310 | Flow cytometry antibody |
| CD45 (PE) | Invitrogen | Cat.: 12-0451-83 | Flow cytometry antibody |
| Centrifuge | Eppendorf | Cat: 5810R | Centrifugation |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Centrifugation |
| Class II biosafety cabinet | Pachane | Cat: 200 | Biosafety cabinet for sterile procedures |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Model: 3110 | Primary cells maintenance |
| Conical tubes 15 mL | Corning | Cat: 430766 | Plastic material |
| Conical tubes 50 mL | Corning | Cat: 352070 | Plastic material |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | Cat: C10281 | Cell counter |
| DAPI | Invitrogen | Cat.: D1306 | Immunofluorescence antidoby |
| Digital Microscope Camera | Nikon | Cat: DS-RI1 | Capture images on microscope |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | Cat: 12800-058 | Cell culture medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | Cat: E9884 | FACS Buffer preparation |
| F12 Nutrient Mixture | Gibco | Cat: 21700-026 | Cell culture medium |
| FACS Canto II | BD Biosciences | Unavaiable | Flow cytometer |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | LGC Biotechnology | Cat: 10-bio500-1 | Cell culture medium supplement |
| Flow Jo (software) | Flow Jo | Version: Flow Jo_9.9.4 | Data analysis |
| Fluorescence intenselight | Nikon | Cat: C-HGFI | Fluorescence source |
| GFAP (APC) | Invitrogen | Cat.: 50-9892-82 | Flow cytometry antibody |
| Goat – anti-mouse IgG (FITC) | Kirkeegood&Perry Lab (KPL) | Cat.: 172-1806 | Immunofluorescence antidoby |
| HBSS – Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | Cat: 14175079 | Cell culture medium |
| HEPES | Sigma Aldrich | Cat: H4034 | Cell culture medium supplement |
| IC Fixation Buffer | Invitrogen | Cat: 00-8222-49 | Cell fixation for Flow Citometry |
| Inverted microscope | Nikon | Model: ECLIPSE TS100 | Microscope |
| Isoflurane | Cristália | Cat: 21.2665 | Inhaled anesthetic |
| Methanol | Synth | Cat: 01A1085.01.BJ | Fixation for Immunofluorescence |
| Micro spatula | ABC stainless | Unavaiable | Surgical material |
| Microtube 1.5 mL | Axygen | Cat: MCT-150-C | Plastic material |
| Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 | Non commercial | Non commercial | Immunofluorescence antidoby |
| Multichannel Pipette (p200) | Corning | Cat: 751630124 | Pipette reagents |
| NIS Elements Software | Nikon | Version 4.0 | Acquire and analyse images |
| Non-fat milk | Nestlé | Cat: 9442405 | Blocking solution for immunofluorescence |
| Orbital Shaker Incubator | ThermoScientific | Model: 481 Cat: 11 | Dissociate microglia from astrocytes |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | Cat: P6148 | Fixation for Immunofluorescence |
| PBS | Non commercial | Non commercial | Neutral Buffer |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | Cat: P-7794 | Cell culture medium supplement |
| Permeabilization Buffer (10X) | Invitrogen | Cat: 00-8333-56 | Cell permeabilization for Flow Citometry |
| Petri dish 60×15 mm (Disposable, sterile) | Prolab | Cat: 0303-8 | Plastic material |
| pH meter | Kasvi | K39-1014B | Calibrate pH solution |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | Cat: 31800-014 | Cell culture medium |
| Scissors | ABC stainless | Cat: LO9-W4 | Surgical material |
| Serological pipette 10 mL | Corning | Cat: 4101 | Plastic material |
| Serological pipette 5 mL | Corning | Cat: 4051 | Plastic material |
| Single Channel Pipette (p1000) | Gilson Pipetman | Cat: F123602 | Pipette reagents |
| Single Channel Pipette (p200) | Gilson Pipetman | Cat: F123601 | Pipette reagents |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | Cat: S6297 | Cell culture medium supplement |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma Aldrich | Cat: S9137 | Cell culture medium supplement |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | Cat: T9284 | Permeabilization for immunofluorescence |
| Trypsin | Gibco | Cat: 27250-018 | Digestive enzyme |
| Tweezers | ABC stainless | Cat: L28-P4-172 | Surgical material |
| Water Bath | Novatecnica | Model: 09020095 | Digeste tissue at 37 ºC with trypsin |
Referências
- Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Jäkel, S., Dimou, L. Glial Cells and Their Function in the Adult Brain: A Journey through the History of Their Ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1-17 (2017).
- Streit, W. J. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia. 40 (2), 133-139 (2002).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends in Neuroscience. 32 (12), 638-647 (2009).
- Virchow, R. Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische and pathologische Gewebelehre. Verlag von August Hirschfeld, Berlin. , (1858).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Samartino, C. G., et al. Brucella abortus induces the secretion of proinflammatory mediators from glial cells leading to astrocyte apoptosis. American Journal of Pathology. 176 (3), 1323-1338 (2010).
- Jamilloux, Y., et al. Inflammasome activation restricts Legionella pneumophila replication in primary microglial cells through flagellin detection. Glia. 61 (4), 539-549 (2013).
- Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
- Pacheco, A. L., et al. The impairment in the NLRP3-induced NO secretion renders astrocytes highly permissive to T. cruzi replication. Journal of Leukocyte Biology. 160 (1), 201-207 (2019).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer’s disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
- Lian, H., Roy, E., Zheng, H. Protocol for Primary Microglial Culture Preparation. Bio-Protocol. 6 (21), 1-10 (2016).
- Lüder, C. G. K., Giraldo-Velásquez, M., Sendtner, M., Gross, U. Toxoplasma gondii in primary rat CNS cells: Differential contribution of neurons, astrocytes, and microglial cells for the intracerebral development and stage differentiation. Experimental Parasitology. 92 (1), 23-32 (1999).
- Chagas, C. Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1 (2), (1909).
- Berkowitz, A. L., Raibagkar, P., Pritt, B. S., Mateen, F. J. Neurologic manifestations of the neglected tropical diseases. Journal of Neurological Sciences. 349 (1), 20-32 (2015).
- Jones, J. L., et al. Toxoplasmic encephalitis in HIV-infected persons: risk factors and trends. The Adult/Adolescent Spectrum of Disease Group. AIDS. 10 (12), 1393-1399 (1996).
- Luft, B. J., et al. Toxoplasmic Encephalitis in Patients with the Acquired Immunodeficiency Syndrome. New England Journal of Medicine. 329 (14), 995-1000 (1993).
- Madalosso, G., et al. Chagasic meningoencephalitis: Case report of a recently included AIDS-defining illness in Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 46 (4), 199-202 (2004).
- Rocha, A., et al. Pathology of patients with Chagas’ disease and acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 50 (3), 261-268 (1994).
- Yasukawa, K., et al. Case report: Trypanosoma cruzi meningoencephalitis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (1), 84-85 (2014).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Roederer, M. Compensation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 22 (1), (2002).
- Silva, A. A., et al. Priming astrocytes with TNF enhances their susceptibility to Trypanosoma cruzi infection and creates a self-sustaining inflammatory milieu. Journal of Neuroinflammation. 14 (182), (2017).
- Tsacopoulos, M., Evêquoz-Mercier, V., Perrottet, P., Buchner, E. Honeybee retinal glial cells transform glucose and supply the neurons with metabolic substrate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8727-8731 (1988).
- Nagase, M., Takahashi, Y., Watabe, A. M., Kubo, Y., Kato, F. On-site energy supply at synapses through monocarboxylate transporters maintains excitatory synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2605-2617 (2014).
- Buckman, L. B., Thompson, M. M., Moreno, H. N., Ellacott, K. L. J. Regional astrogliosis in the mouse hypothalamus in response to obesity. Journal of Comparative Neurology. 521 (6), 1322-1333 (2013).
- Vesce, S., Bezzi, P., Volterra, A. The active role of astrocytes in synaptic transmission. Cellular and Molecular Life Sciences. 56 (11-12), 991-1000 (1999).
- Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. The Pathophysiological Role of Microglia in Dynamic Surveillance, Phagocytosis and Structural Remodeling of the Developing CNS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 191 (2017).
- Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
- Sarkar, S., et al. Rapid and refined CD11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility. Journal of Visualized Experiments. (122), e55364 (2017).
- Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (66), e3814 (2012).
