Det övergripande målet med detta protokoll är att instruera hur man extraherar, underhåller och separerar murine astrocyt- och mikrogliaceller från det centrala nervsystemet, följt av infektion med protozoparasiter.
Astrocyter och mikroglia är de vanligast förekommande gliacellerna. De är ansvariga för fysiologiskt stöd och homeostas underhåll i centrala nervsystemet (CNS). De ökande beläggen för deras inblandning i bekämpningen av infektionssjukdomar motiverar det framväxande intresset för att förbättra metoderna för att isolera primära astrocyter och mikroglia för att utvärdera deras svar på infektioner som påverkar CNS. Med tanke på effekterna av Trypanosoma cruzi (T. cruzi) och Toxoplasma gondii (T. gondii)infektion i CNS, här ger vi en metod för att extrahera, underhålla, separera och infektera murine astrocyter och mikroglia celler med protozoa parasiter. Extraherade celler från nyfödda cortices upprätthålls in vitro i 14 dagar med periodiska differentialmedia ersättning. Astrocyter och mikroglia erhålls från samma extraktionsprotokoll genom mekanisk dissociation. Efter fenotypning av flödescytometri är celler infekterade med protozoparasiter. Infektionsfrekvensen bestäms genom fluorescensmikroskopi vid olika tidpunkter, vilket gör det möjligt att utvärdera differentiell förmåga gliaceller att kontrollera protozoiska invasion och replikering. Dessa tekniker representerar enkla, billiga och effektiva metoder för att studera svaren från astrocyter och mikroglia till infektioner, vilket öppnar fältet för ytterligare neuroimmunologi analys.
CNS består huvudsakligen av nervceller och gliaceller1,2,3. Mikroglia och astrocyter är de vanligast förekommande gliacellerna i CNS. Microglia, den inhemska makrofag, är immunkompetenta och fagocytiska glia cellen i CNS3,4, medan astrocyter är ansvariga för att upprätthålla homeostas och utöva stödjande funktioner5.
Trots gliaceller är klassiskt kända för att vara ansvarig för stöd och skydd av nervceller6,7, nya funktioner i dessa celler har beskrivits i den senaste litteraturen, inklusive deras svar på infektioner8,9,10,11. Således finns det en push för att utveckla metoder för att isolera dessa gliaceller för att förstå deras funktioner individuellt.
Det finns några alternativa modeller för att studera gliaceller snarare än primära kulturer, som förevigade cell härstamningar och in vivo-modeller. Emellertid, förevigade celler är mer benägna att genomgå genetiska drivande och morfologiska förändringar, medan in vivo studier införa begränsade manipulation villkor. Omvänt, primära kulturer är lätta att hantera, bättre liknar in vivo celler och även tillåta oss att kontrollera experimentella faktorer12,13. Här beskriver vi riktlinjer för hur man extraherar, underhåller och separerar murine astrocyter och microglia primära celler i samma protokoll. Dessutom ger vi också exempel på hur man arbetar med protozoainfektion i dessa kulturer.
CNS celler utvinns ur neonatal möss (upp till 3 dagar gamla) odlades i 14 dagar på differentiella medier som gör det möjligt att prioritera tillväxt av astrocyter och microglia celler. Eftersom microglia vila ovanför de bifogade astrocytes, cell populationer var mekaniskt separerade i en orbital inkubator. Därefter samlade vi alla supernatant som innehåller mikroglia och lade trypsin att lossa astrocyter. Isolerade gliaceller utvärderades fenotypiskt av flöde cytometri och pläterade enligt önskat experiment.
Vi gav också exempel på hur man infekterar dessa isolerade mikroglia och astrocyter med protozoparasiter. T. gondii är en mycket neurotrop protozo som ansvarar för toxoplasmos14, medan T. cruzjag är ansvarig för Chagas sjukdom som kan leda till utveckling av neurologiska sjukdomar i CNS15,16. Dessutom har det också rapporterats att infektion med T. gondii17,18 eller T. cruzi19,20,21 var den förmodligen dödsorsaken i immunkomprometterade patienter. Därför är förtydligandet av immunologiska roll gliaceller från CNS för att kontrollera protozoa infektioner av stor betydelse.
Vikten av att studera isolerade gliaceller fungerar i olika biologiska sammanhang har expanderat under de senaste två decennierna. Förstå CNS bortom nervceller är fortfarande ett växande område i cellbiologi, särskilt under infektioner eller inflammatoriska tillstånd8,9,24. Glialceller är avgörande inte bara för nervceller fysiskt stöd (som det tidigare var känt), men också i många andra fysiologiska situationer s…
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka professor Dr Renato A. Mortara från Federal University of São Paulo (UNIFESP) för mAb 2C2 anti-Ssp-4. Detta arbete stöddes av bidrag från Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, bidrag 2017/25942-0 till K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, bidrag 402100/2016-6 till K.R.B.), Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas (INCTV/CNPq) och Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Finance Code 001). M.P.A. får stipendium från CNPq, A.L.O.P. får stipendium från CAPES, och I.S.F och L.Z.M.F.B. får stipendium från FAPESP.
70% Ethanol | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: 2231 | Sterilize |
75 cm2 Flask | Corning | Cat: 430720U | Plastic material |
96 well cell culture plate | Greiner Cellstar | Cat: 655090 | Cell culture |
Ammonium Chloride (NH4Cl) | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: C10337.01.AH | Remove autofluorescence |
Anti-GFAP antibody | Abcam | Cat.: ab49874 | Immunofluorescence antidoby |
Bottle Top Filter 0.22 mm CA | Corning | Cat: 430513 | Culture medium filter |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | Cat: A7906 | FACS Buffer preparation |
CD11b (FITC) | BD Pharmigen | Cat.: 553310 | Flow cytometry antibody |
CD45 (PE) | Invitrogen | Cat.: 12-0451-83 | Flow cytometry antibody |
Centrifuge | Eppendorf | Cat: 5810R | Centrifugation |
Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Centrifugation |
Class II biosafety cabinet | Pachane | Cat: 200 | Biosafety cabinet for sterile procedures |
CO2 Incubator | ThermoScientific | Model: 3110 | Primary cells maintenance |
Conical tubes 15 mL | Corning | Cat: 430766 | Plastic material |
Conical tubes 50 mL | Corning | Cat: 352070 | Plastic material |
Countess automated cell counter | Invitrogen | Cat: C10281 | Cell counter |
DAPI | Invitrogen | Cat.: D1306 | Immunofluorescence antidoby |
Digital Microscope Camera | Nikon | Cat: DS-RI1 | Capture images on microscope |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | Cat: 12800-058 | Cell culture medium |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | Cat: E9884 | FACS Buffer preparation |
F12 Nutrient Mixture | Gibco | Cat: 21700-026 | Cell culture medium |
FACS Canto II | BD Biosciences | Unavaiable | Flow cytometer |
Fetal Bovine Serum (FBS) | LGC Biotechnology | Cat: 10-bio500-1 | Cell culture medium supplement |
Flow Jo (software) | Flow Jo | Version: Flow Jo_9.9.4 | Data analysis |
Fluorescence intenselight | Nikon | Cat: C-HGFI | Fluorescence source |
GFAP (APC) | Invitrogen | Cat.: 50-9892-82 | Flow cytometry antibody |
Goat – anti-mouse IgG (FITC) | Kirkeegood&Perry Lab (KPL) | Cat.: 172-1806 | Immunofluorescence antidoby |
HBSS – Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | Cat: 14175079 | Cell culture medium |
HEPES | Sigma Aldrich | Cat: H4034 | Cell culture medium supplement |
IC Fixation Buffer | Invitrogen | Cat: 00-8222-49 | Cell fixation for Flow Citometry |
Inverted microscope | Nikon | Model: ECLIPSE TS100 | Microscope |
Isoflurane | Cristália | Cat: 21.2665 | Inhaled anesthetic |
Methanol | Synth | Cat: 01A1085.01.BJ | Fixation for Immunofluorescence |
Micro spatula | ABC stainless | Unavaiable | Surgical material |
Microtube 1.5 mL | Axygen | Cat: MCT-150-C | Plastic material |
Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 | Non commercial | Non commercial | Immunofluorescence antidoby |
Multichannel Pipette (p200) | Corning | Cat: 751630124 | Pipette reagents |
NIS Elements Software | Nikon | Version 4.0 | Acquire and analyse images |
Non-fat milk | Nestlé | Cat: 9442405 | Blocking solution for immunofluorescence |
Orbital Shaker Incubator | ThermoScientific | Model: 481 Cat: 11 | Dissociate microglia from astrocytes |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | Cat: P6148 | Fixation for Immunofluorescence |
PBS | Non commercial | Non commercial | Neutral Buffer |
Penicillin G | Sigma Aldrich | Cat: P-7794 | Cell culture medium supplement |
Permeabilization Buffer (10X) | Invitrogen | Cat: 00-8333-56 | Cell permeabilization for Flow Citometry |
Petri dish 60×15 mm (Disposable, sterile) | Prolab | Cat: 0303-8 | Plastic material |
pH meter | Kasvi | K39-1014B | Calibrate pH solution |
RPMI 1640 Medium | Gibco | Cat: 31800-014 | Cell culture medium |
Scissors | ABC stainless | Cat: LO9-W4 | Surgical material |
Serological pipette 10 mL | Corning | Cat: 4101 | Plastic material |
Serological pipette 5 mL | Corning | Cat: 4051 | Plastic material |
Single Channel Pipette (p1000) | Gilson Pipetman | Cat: F123602 | Pipette reagents |
Single Channel Pipette (p200) | Gilson Pipetman | Cat: F123601 | Pipette reagents |
Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | Cat: S6297 | Cell culture medium supplement |
Streptomycin sulfate salt | Sigma Aldrich | Cat: S9137 | Cell culture medium supplement |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | Cat: T9284 | Permeabilization for immunofluorescence |
Trypsin | Gibco | Cat: 27250-018 | Digestive enzyme |
Tweezers | ABC stainless | Cat: L28-P4-172 | Surgical material |
Water Bath | Novatecnica | Model: 09020095 | Digeste tissue at 37 ºC with trypsin |