Det overordnede målet med denne protokollen er å instruere hvordan man trekker ut, opprettholder og dissosierer murineastrocyte og microglia celler fra sentralnervesystemet, etterfulgt av infeksjon med protozoa parasitter.
Astrocytter og mikroglia er de mest tallrike glialcene. De er ansvarlige for fysiologisk støtte og homeostase vedlikehold i sentralnervesystemet (CNS). De økende bevisene for deres engasjement i kontroll av smittsomme sykdommer rettferdiggjør den nye interessen for forbedring av metoder for å isolere primære astrocytter og mikroglia for å evaluere deres respons på infeksjoner som påvirker CNS. Tatt i betraktning virkningen av Trypanosoma cruzi (T. cruzi) og Toxoplasma gondii (T. gondii) infeksjon i CNS, her gir vi en metode for å trekke ut, opprettholde, dissosiere og infisere murine astrocytes og microglia celler med protozoa parasitter. Ekstraherte celler fra nyfødte kortices opprettholdes in vitro i 14 dager med periodisk differensial media erstatning. Astrocytter og mikroglia er hentet fra samme ekstraksjonsprotokoll ved mekanisk dissosiasjon. Etter fenotyping ved flyt cytometri, er celler smittet med protozoer parasitter. Infeksjonsraten bestemmes av fluorescensmikroskopi på forskjellige tidspunkter, slik at evalueringen av differensialevne av glialceller for å kontrollere protozosk invasjon og replikering. Disse teknikkene representerer enkle, billige og effektive metoder for å studere svarene fra astrocytter og mikroglia til infeksjoner, og åpner feltet for videre nevroimmunologianalyse.
CNS består hovedsakelig av nevroner og glialceller1,,2,3. Microglia og astrocytter er de mest tallrike gliacellene i CNS. Microglia, bosatt makrofag, er immunokompetent og fagocytisk glia celle i CNS3,4, mens astrocytter er ansvarlig for å opprettholde homeostase og utøve støttende funksjoner5.
Til tross for glial celler blir klassisk kjent for å være ansvarlig for støtte og beskyttelse av nevroner6,7, nye funksjoner av disse cellene har blitt beskrevet i den siste litteraturen, inkludert deres svar på infeksjoner8,9,10,11. Dermed er det et press for å utvikle metoder for å isolere disse glialcene for å forstå sine funksjoner individuelt.
Det er noen alternative modeller for å studere glialceller i stedet for primære kulturer, som udødeliggjorte cellelinjer og in vivo-modeller. Imidlertid er udødelige celler mer sannsynlig å gjennomgå genetiskdrivende og morfologiske endringer, mens in vivo studier pålegge begrensede manipulasjonforhold. Omvendt er primære kulturer enkle å håndtere, ligner bedre på vivo-celler og tillater oss også å kontrollere eksperimentelle faktorer12,13. Her beskriver vi retningslinjer for hvordan du trekker ut, vedlikeholder og dissosierer murineastrocytter og mikroglia primære celler i samme protokoll. Videre gir vi også eksempler på hvordan man arbeider med protozoinfeksjon i disse kulturene.
CNS-celler hentet fra nyfødte mus (opptil 3 dager gamle) ble dyrket i 14 dager på differensialmedier som gjør det mulig å fortrinnsrett vekst av astrocytter og mikrogliaceller. Siden microglia hviler over de vedlagte astrocytter, ble cellepopulasjoner mekanisk dissosiert i en orbital inkubator. Deretter samlet vi alle supernatantsominneholder microglia og lagt trypsin å løsne astrocytter. Isolerte glialceller ble fenotypisk evaluert av flow cytometri og belagt i henhold til ønsket eksperiment.
Vi ga også eksempler på hvordan man infiserer disse isolerte mikroglia og astrocytter med protozoaparasitter. T. gondii er en svært nevrotropisk protozoansvarlig ansvarlig for toksoplasmose14, mens T. cruzjeg er ansvarlig for Chagas sykdom som kan føre til utvikling av nevrologiske lidelser i CNS15,16. Videre har det også blitt rapportert at infeksjon med T. gondii17,18 eller T. cruzi19,20,21 var den antatte dødsårsaken hos immunkompromitterte pasienter. Derfor er oppklaringen av immunologiske rolle glialceller fra CNS i å kontrollere protozoer infeksjoner av stor betydning.
Viktigheten av å studere isolerte glialceller fungerer i forskjellige biologiske sammenhenger har ekspandert de siste to tiårene. Forstå CNS utover nevroner er fortsatt et voksende felt i cellebiologi, spesielt under infeksjoner eller inflammatoriske forhold8,9,24. Glialceller er avgjørende ikke bare for nevroner fysisk støtte (som det tidligere var kjent), men også i mange andre fysiologiske situasjoner som nevron energif…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke professor Dr. Renato A. Mortara fra Federal University of São Paulo (UNIFESP) for mAb 2C2 anti-Ssp-4. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, stipend 2017/25942-0 til K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, gi 402100/2016-6 til K.R.B.), Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas (INCTV/CNPq) og Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Finance Code 001). M.P.A. mottar fellesskap fra CNPq, A.L.O.P. mottar fellesskap fra CAPES, og I.S.F og L.Z.M.F.B. mottar fellesskap fra FAPESP.
70% Ethanol | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: 2231 | Sterilize |
75 cm2 Flask | Corning | Cat: 430720U | Plastic material |
96 well cell culture plate | Greiner Cellstar | Cat: 655090 | Cell culture |
Ammonium Chloride (NH4Cl) | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: C10337.01.AH | Remove autofluorescence |
Anti-GFAP antibody | Abcam | Cat.: ab49874 | Immunofluorescence antidoby |
Bottle Top Filter 0.22 mm CA | Corning | Cat: 430513 | Culture medium filter |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | Cat: A7906 | FACS Buffer preparation |
CD11b (FITC) | BD Pharmigen | Cat.: 553310 | Flow cytometry antibody |
CD45 (PE) | Invitrogen | Cat.: 12-0451-83 | Flow cytometry antibody |
Centrifuge | Eppendorf | Cat: 5810R | Centrifugation |
Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Centrifugation |
Class II biosafety cabinet | Pachane | Cat: 200 | Biosafety cabinet for sterile procedures |
CO2 Incubator | ThermoScientific | Model: 3110 | Primary cells maintenance |
Conical tubes 15 mL | Corning | Cat: 430766 | Plastic material |
Conical tubes 50 mL | Corning | Cat: 352070 | Plastic material |
Countess automated cell counter | Invitrogen | Cat: C10281 | Cell counter |
DAPI | Invitrogen | Cat.: D1306 | Immunofluorescence antidoby |
Digital Microscope Camera | Nikon | Cat: DS-RI1 | Capture images on microscope |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | Cat: 12800-058 | Cell culture medium |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | Cat: E9884 | FACS Buffer preparation |
F12 Nutrient Mixture | Gibco | Cat: 21700-026 | Cell culture medium |
FACS Canto II | BD Biosciences | Unavaiable | Flow cytometer |
Fetal Bovine Serum (FBS) | LGC Biotechnology | Cat: 10-bio500-1 | Cell culture medium supplement |
Flow Jo (software) | Flow Jo | Version: Flow Jo_9.9.4 | Data analysis |
Fluorescence intenselight | Nikon | Cat: C-HGFI | Fluorescence source |
GFAP (APC) | Invitrogen | Cat.: 50-9892-82 | Flow cytometry antibody |
Goat – anti-mouse IgG (FITC) | Kirkeegood&Perry Lab (KPL) | Cat.: 172-1806 | Immunofluorescence antidoby |
HBSS – Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | Cat: 14175079 | Cell culture medium |
HEPES | Sigma Aldrich | Cat: H4034 | Cell culture medium supplement |
IC Fixation Buffer | Invitrogen | Cat: 00-8222-49 | Cell fixation for Flow Citometry |
Inverted microscope | Nikon | Model: ECLIPSE TS100 | Microscope |
Isoflurane | Cristália | Cat: 21.2665 | Inhaled anesthetic |
Methanol | Synth | Cat: 01A1085.01.BJ | Fixation for Immunofluorescence |
Micro spatula | ABC stainless | Unavaiable | Surgical material |
Microtube 1.5 mL | Axygen | Cat: MCT-150-C | Plastic material |
Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 | Non commercial | Non commercial | Immunofluorescence antidoby |
Multichannel Pipette (p200) | Corning | Cat: 751630124 | Pipette reagents |
NIS Elements Software | Nikon | Version 4.0 | Acquire and analyse images |
Non-fat milk | Nestlé | Cat: 9442405 | Blocking solution for immunofluorescence |
Orbital Shaker Incubator | ThermoScientific | Model: 481 Cat: 11 | Dissociate microglia from astrocytes |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | Cat: P6148 | Fixation for Immunofluorescence |
PBS | Non commercial | Non commercial | Neutral Buffer |
Penicillin G | Sigma Aldrich | Cat: P-7794 | Cell culture medium supplement |
Permeabilization Buffer (10X) | Invitrogen | Cat: 00-8333-56 | Cell permeabilization for Flow Citometry |
Petri dish 60×15 mm (Disposable, sterile) | Prolab | Cat: 0303-8 | Plastic material |
pH meter | Kasvi | K39-1014B | Calibrate pH solution |
RPMI 1640 Medium | Gibco | Cat: 31800-014 | Cell culture medium |
Scissors | ABC stainless | Cat: LO9-W4 | Surgical material |
Serological pipette 10 mL | Corning | Cat: 4101 | Plastic material |
Serological pipette 5 mL | Corning | Cat: 4051 | Plastic material |
Single Channel Pipette (p1000) | Gilson Pipetman | Cat: F123602 | Pipette reagents |
Single Channel Pipette (p200) | Gilson Pipetman | Cat: F123601 | Pipette reagents |
Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | Cat: S6297 | Cell culture medium supplement |
Streptomycin sulfate salt | Sigma Aldrich | Cat: S9137 | Cell culture medium supplement |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | Cat: T9284 | Permeabilization for immunofluorescence |
Trypsin | Gibco | Cat: 27250-018 | Digestive enzyme |
Tweezers | ABC stainless | Cat: L28-P4-172 | Surgical material |
Water Bath | Novatecnica | Model: 09020095 | Digeste tissue at 37 ºC with trypsin |