Kombinera fluidiska enheter med mikroskopi och flödescytometri för att studera mikrobiell transport i porösa medier över rumsliga skalor

Summary

Genombrottskurvor (BTCs) är effektiva verktyg för att studera transport av bakterier i porösa medier. Här introducerar vi verktyg baserade på fluidiska enheter i kombination med mikroskopi och flödescytometrisk räkning för att erhålla BTC.

Abstract

Att förstå mikroorganismers transport, spridning och nedfall i porösa medier är en komplex vetenskaplig uppgift som omfattar så skilda ämnen som hydrodynamik, ekologi och miljöteknik. Att modellera bakterietransport i porösa miljöer på olika rumsliga skalor är avgörande för att bättre förutsäga konsekvenserna av bakterietransport, men nuvarande modeller misslyckas ofta till att upp-skala från laboratoriet till fältförhållanden. Här introducerar vi experimentella verktyg för att studera bakterietransport i porösa medier i två rumsliga skalor. Syftet med dessa verktyg är att få makroskopiska observabler (såsom genombrottskurvor eller depositionsprofiler) av bakterier som injiceras i genomskinliga porösa matriser. I den lilla skalan (10-1000 μm) kombineras mikrofluidiska anordningar med optisk videomikroskopi och bildbehandling för att få genombrottskurvor och samtidigt spåra enskilda bakterieceller i porskalan. I större skala kombineras flödescytometri med en egentillverkad robotdispenser för att få genombrottskurvor. Vi illustrerar nyttan av dessa verktyg för att bättre förstå hur bakterier transporteras i komplexa porösa medier som hyporheic zon av strömmar. Eftersom dessa verktyg ger samtidiga mätningar över skalor, bana de väg för mekanism-baserade modeller, kritiskt viktigt för uppskalning. Tillämpning av dessa verktyg kan inte bara bidra till utvecklingen av nya bioremediering applikationer men också kasta nytt ljus över de ekologiska strategier mikroorganismer kolonisera porösa substrat.

Introduction

Studier som syftar till att förstå transport av mikrober genom porösa medier har främst drivits av oro för^{kontaminering 1}, överföring av^{sjukdom 2} och bioremediering³. I detta avseende har bakterier mestadels behandlats som partiklar i transportmodeller⁴ och processer som filtrering, sila, gravitationell sedimentering eller remobilisering från biofilmer har identifierats som förare av retention eller transport av mikrober⁵. Men att studera transport av bakterier genom porösa landskap kan också informera oss om de ekologiska strategier som ligger till grund för deras framgång i dessa komplexa miljöer. Ändå kräver detta nya experiment och matematiska modeller som verkar på encell, befolkning eller mikrobiell gemenskap nivå.

Naturliga porösa miljöer, såsom de som finns i hyporézonen av bäckar och floder, är tätt koloniserade av olika samhällen av biofilmbildande mikrober⁶. Biofilmer bildar strukturer som modifierar flödet och därmed transport och spridning av bakterier i^{vätskefasen 7,8}. Transport av bakterier i porskala beror på den begränsade utrymme tillgängligheten i den porösa matrisen och motility-relaterade spridning kan vara ett effektivt sätt att öka den individuella konditionen genom minskad konkurrens om resurser i mindre tätbefolkade områden. Å andra sidan kan motila bakterier också nå mer isolerade regioner i den porösa matrisen och den utökade utforskningen av sådana områden kan ge ekologiska möjligheter att motila populationer¹⁰. Vid större rumsliga skalor, avleder biofilm tillväxt flödet vägar också leder till (partiell) igensättning av porer och, därmed, till inrättandet av ännu mer kanaliseras och heterogena flödesförhållanden¹¹. Detta får konsekvenser för näringstillförsel och spridningsförmåga, frekvens och avstånd. Förmånsflöde, till exempel, kan generera så kallade “fast-tracks” och motila bakterier kan uppnå ännu högre hastigheter än det lokala flödet längs dessa spår¹². Detta är ett effektivt sätt att öka utforskningen av nya livsmiljöer.

En mängd olika verktyg begagar sig för studier av transport av motila och icke-motila bakterier (och partiklar) i porösa medier. Numeriska modeller har stora prediktiva kapaciteter som är viktiga för tillämpningar, dock ofta begränsas av inneboende antaganden⁴. Experiment i laboratorieskala^{13,14 i kombination} med modellering av genombrottskurva (BTC) har gett viktiga insikter i betydelsen av bakteriella cellytegenskaper för att fastna effektivitet¹⁵. Vanligtvis erhålls BTCs (dvs. gånger serie av partikelkoncentration på en fast plats) via konstant-rate releaser och mätning av cellnummer vid utflödet av den experimentella enheten. I detta sammanhang, BTCs återspeglar advection-dispersion dynamiken hos bakterier i den porösa matrisen och kan förlängas med en diskbänk sikt redovisning av kvarstad. Modellering av BCC ensam inte lösa dock rollen av rumslig organisation av det porösa substrat eller biofilm för transportprocesser. Andra makroskopiska observables som dispersivity eller deposition profiler har visat sig ge viktig information om den rumsliga fördelningen eller de bevarade partiklar eller växande samhällen. Microfluidics är en teknik som gör det möjligt att studera transporter i porösa medier genom mikroskopi undersökning^9,12,16, och utom en nyligen arbete¹⁰, experimentella system är vanligtvis begränsas till en enda längd skala av upplösning, det vill säga porskalan eller hela fluidic enhet skala.

Här introducerar vi en svit av kombinerade metoder för att studera transporten av motila och icke-motila bakterier i porösa landskap i olika skalor. Vi kombinerar observationer av bakterietransport i porskalan med information i större skala, med hjälp av BTC-analys. Mikrofluidiska anordningar byggda av mjuk litografi med hjälp av polydimetylsiloxan (PDMS) är biokompatibla, resistenta mot en rad kemikalier, möjliggör replikerbarhet till låga kostnader och ger utmärkt optisk transparens samt låg autofluorescens som är kritisk för mikroskopisk observation. Mikrofluidik baserad på PDMS har tidigare använts för att studera transport av mikrober i enkla kanaler¹⁷ eller i mer komplexa geometrier¹². Men typiskt mikrofluidik experiment fokus på kortsiktiga horisonter och epi-fluorescens mikroskopisk observation av levande celler är vanligen begränsad till genetiskt modifierade stammar (t.ex. GFP-taggade stammar). Här presenterar vi verktyg för att studera bakteriell transport med hjälp av PDMS-baserade mikrofluidiska enheter i kombination med mikroskopi och större enheter som är tillverkade av poly(metylmetakrylat) (PMMA, även känd som plexiglas) i kombination med flödescytometri. PDMS och PMMA skiljer sig åt i gaspermeabilitet och ytegenskaper, vilket ger komplementära möjligheter att studera bakterietransport. Medan den mikrofluidiska enheten ger en mer kontrollerad miljö, den större enheten möjliggör experiment under längre tidsperioder eller med hjälp av naturliga bakteriesamhällen. Mikroskopi som räknar med hög temporal upplösning i ett dedikerat område används för att erhålla BTC i den PDMS-baserade mikrofluidiska enheten. För att erhålla cellantal för BTC-modellering från den PMMA-baserade enheten introducerar vi en egenkonstruerad automatiserad vätskedispenser i kombination med flödescytometri. I denna inställning passerar celler den fluidiska enheten och lämnas i följd ut i 96 brunnsplattor. Den tidsmässiga upplösningen begränsas av den minsta volym som kan avdistlades exakt och därmed medelflödet genom den fluidiska enheten. Fixativ i brunnarna förhindrar tillväxt och underlättar DNA-färgning för nedströms flödes-cytometrisk uppräkning. För att förhindra bakterietillväxt under transport experiment vi använder en minimal medium (termed motility buffert).

Eftersom protokoll för beredning av fluidiska enheter i olika skalor är lätt tillgängliga, vi bara kortfattat införa tekniker för att producera sådana enheter och snarare fokusera på experimentella förfaranden för att spela in BTCs. På samma sätt finns olika rutiner för flödet cytometric uppräkning av mikrober och användare kräver expertkunskap för att tolka resultat som erhållits genom flödescytometri. Vi rapporterar den nya användningen av mikrofluidiska enheter i kombination med mikroskopisk avbildning för att registrera BTCs av fluorescently-taggade celler. I porskalan erhålls lokala hastigheter och banor med hjälp av bildbehandling. Vidare visar vi användningen av en PMMA-baserade fluidic enhet i kombination med flöde-cytometric räkna att observera bakteriell transport av motila och icke-motila celler i porösa miljöer koloniseras av en native stream biofilm.

Protocol

1. Bakteriekulturens villkor Arbeta under en laminär flöde huva, använd 100 μL av ett glycerol lager av GFP-taggade Pseudomonas putida KT2440 (1 × 107 mL-1, lagras vid -80 °C) att inokulera 5 mL Luria-Bertani (LB) medium. Inkubera vid 30 °C medan du skakar vid 250 rpm över natten. Nästa dag, återanvänd 100 μL av övernattningskulturen i 5 mL LB-medium och inkubera under samma förhållanden för 5h (exponentiell fas). Provsök en 1 mL alikvot i ett 2 mL-rör,…

Representative Results

För att illustrera funktionaliteten i det presenterade arbetsflödet utförde vi experiment med hjälp av genetiskt modifierade Pseudomonas putida KT2440, en gramnegativ motilbakterie som är viktig för bioremediering och bioteknik. Genetiskt modifierade versioner av denna stam som uttrycker GFP-produktion är kommersiellt tillgängliga. En icke-motil stam av P. putida KT2440 som saknar de relevanta strukturella och reglerande gener för motilitet finns också. Använd…

Discussion

Här föreslår vi två sätt att studera transport av mikrober genom porösa system på encells- och populationsnivå. Medan studiet av transportfenomen med hjälp av BTC-modellering har gett värdefulla insikter om spridningen av patogener eller föroreningar vid ekosystemskalorna, finns det fortfarande svårigheter att skala från laboratorieexperiment till fältförhållanden. De verktyg som beskrivs här gör det möjligt för forskare att experimentellt lösa de rumsliga och tidsmässiga skalorna för att bättre f…

Materials

EDTA	Sigma
Elastomer Sylgard 184	Dowsil	101697
Flow cytometer NovoCyte	Acea
Glucose	Sigma		https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit
LB broth	BD
Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit	makeblock
Microscope Axio Imager	Zeiss
Microscope AxioZoom v16	Zeiss
Microscope slides, 75 mm × 25 mm	Corning
Minipuls 3 peristaltic pump	Gilson
Plasma bonder Corona SB	BlackHole Lab
Potassium phosphate	Sigma
Syringe pump New Era NE 4000	New Era
Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain	Molecular Probes, Invitrogen
Tygon tubing	Ismatec
WF31SA universal milling machine	Mikron