Kombinere fluidiske enheter med mikroskopi og strømningscytometri for å studere mikrobiell transport i porøse medier på tvers av romlige skalaer

Summary

Banebrytende kurver (BTCer) er effektive verktøy for å studere transport av bakterier i porøse medier. Her introduserer vi verktøy basert på fluidiske enheter i kombinasjon med mikroskopi og flytcytokometrisk telling for å oppnå BTCer.

Abstract

Å forstå transport, spredning og avsetning av mikroorganismer i porøse medier er en kompleks vitenskapelig oppgave bestående av emner så forskjellige som hydrodynamikk, økologi og miljøteknikk. Modellering av bakteriell transport i porøse miljøer i ulike romlige skalaer er avgjørende for å bedre forutsi konsekvensene av bakteriell transport, men dagens modeller klarer ofte ikke å oppskalere fra laboratorie-til-feltforhold. Her introduserer vi eksperimentelle verktøy for å studere bakteriell transport i porøse medier på to romlige skalaer. Målet med disse verktøyene er å oppnå makroskopiske observerbare (for eksempel gjennombruddskurver eller avsetningsprofiler) av bakterier injisert i gjennomsiktige porøse matriser. I liten skala (10-1000 μm) kombineres mikrofluidiske enheter med optisk videomikroskopi og bildebehandling for å oppnå gjennombruddskurver og samtidig spore individuelle bakterielle celler i poreskalaen. I større skala kombineres strømningscytometri med en selvskapt robotdispenser for å oppnå gjennombruddskurver. Vi illustrerer nytten av disse verktøyene for å bedre forstå hvordan bakterier transporteres i komplekse porøse medier som den hypoheiske sonen av bekker. Etter hvert som disse verktøyene gir samtidige målinger på tvers av skalaer, baner de vei for mekanismebaserte modeller, kritisk viktige for oppskalering. Anvendelse av disse verktøyene kan ikke bare bidra til utviklingen av nye bioremediation applikasjoner, men også kaste nytt lys over de økologiske strategiene for mikroorganismer kolonisere porøse substrater.

Introduction

Studier som tar sikte på å forstå transport av mikrober gjennom porøse medier har hovedsakelig vært drevet av bekymringer for forurensning^1,overføring av^{sykdom 2} og bioremediation³. I denne forbindelse har bakterier for det meste blitt behandlet som partikler i transportmodeller^4, og prosesser som filtrering, belastning, gravitasjonsoppgjør eller remobilisering fra biofilmer har blitt identifisert som drivere for oppbevaring eller transport av mikrober⁵. Men å studere transport av bakterier gjennom porøs landskap kan også informere oss om de økologiske strategiene som underbygger deres suksess i disse komplekse miljøene. Likevel krever dette nye eksperimenter og matematiske modeller som opererer på enkeltcelle, befolkning eller mikrobiell samfunnsnivå.

Naturlige porøse miljøer, som de som finnes i den hyporheiske sonen av bekker og elver, koloniseres tett av ulike samfunn av biofilmdannende mikrober⁶. Biofilmer danner strukturer som endrer strømmen og dermed transport og spredning av bakterier i væskefase^7,8. Transport av bakterier i poreskalaen avhenger av begrenset plasstilgjengelighet i porøs matrise og motilitetsrelatert spredning kan være en effektiv måte å øke den individuelle formen gjennom redusert konkurranse om ressurser i mindre tett befolkede områder. På den annen side kan motile bakterier også nå mer isolerte områder av porøs matrise, og den utvidede utforskningen av slike områder kan gi økologiske muligheter til motile^{populasjoner 10}. Ved større romlige skalaer avleder biofilmveksten strømningsbanene som også fører til (delvis) tilstopping av porer og dermed til etablering av enda mer kanaliserte og heterogene strømningsforhold¹¹. Dette har konsekvenser for næringsforsyning og spredningskapasitet, frekvens og avstand. Fortrinnsrett flyt, for eksempel, kan generere såkalte “fast-spor” og motile bakterier kan oppnå enda høyere hastigheter enn den lokale flyten langs disse^{sporene 12}. Dette er en effektiv måte å øke utforskningen av nye habitater på.

En rekke verktøy benytte seg for studiet av transport av motile og ikke-motile bakterier (og partikler) i porøse medier. Numeriske modeller har stor prediktiv kapasitet som er viktige for applikasjoner, men er ofte begrenset av iboende antagelser⁴. Laboratorieskala eksperimenter^13,14 kombinert med banebrytende kurve (BTC) modellering har gitt viktig innsikt i viktigheten av bakterielle celle overflateegenskaper for å stikke effektivitet¹⁵. Vanligvis oppnås BTCer (det vil vil vil vil at tider serie med partikkelkonsentrasjon på et fast sted) oppnås via konstanthastighetsutgivelser og måling av celletall ved utløpet av den eksperimentelle enheten. I denne sammenheng reflekterer BTCene adveksjonsspredningsdynamikken til bakterier i porøs matrise og kan utvides med et synkebelegg som står for vedlegg. Modellering av BTCer alene løser imidlertid ikke rollen som romlig organisering av porøs substrat eller biofilm for transportprosesser. Andre makroskopiske observerbare enheter som dispersivitet eller deponeringsprofiler har vist seg å gi viktig informasjon om romlig fordeling eller de beholdt partiklene eller voksende samfunnene. Microfluidics er en teknologi som gjør det mulig å studere transport i porøse medier ved mikroskopiundersøkelse^9,,12,,16,og bortsett fra et nylig arbeid^10,er eksperimentelle systemer vanligvis begrenset til en enkelt lengde skala av oppløsning, det vil si poreskalaen eller hele fluidisk enhetsskala.

Her introduserer vi en rekke kombinerte metoder for å studere transport av motile og ikke-motile bakterier i porøs landskap i forskjellige skalaer. Vi kombinerer observasjoner av bakteriell transport i poreskalaen med informasjon i større skala, ved hjelp av BTC-analyse. Mikrofluidiske enheter bygget av myk litografi ved hjelp av polydimetylsiloxane (PDMS) er biokompatibele, motstandsdyktige mot en rekke kjemikalier, tillater replikerbarhet til lave kostnader og gir utmerket optisk gjennomsiktighet samt lav autofluorescens kritisk for mikroskopisk observasjon. Mikrofluidics basert på PDMS har tidligere blitt brukt til å studere transport av mikrober i enkle^{kanaler 17} eller i mer komplekse geometrier¹². Imidlertid fokuserer typisk mikrofluidics eksperimenter på kortsiktige horisonter og epi-fluorescens mikroskopisk observasjon av levende celler er ofte begrenset til genmodifiserte stammer (f.eks GFP-merkede stammer). Her presenterer vi verktøy for å studere bakteriell transport ved hjelp av PDMS-baserte mikrofluidiske enheter i kombinasjon med mikroskopi og større enheter fabrikkert fra poly(metylmetakkrylat) (PMMA, også kjent som plexiglass) i kombinasjon med strømningscytometri. PDMS og PMMA varierer i gasspermeabilitet og overflateegenskaper, og gir dermed komplementære muligheter til å studere bakteriell transport. Mens den mikrofluidiske enheten gir et mer kontrollert miljø, gjør den større enheten mulighet for eksperimenter over lengre perioder eller bruk av naturlige bakterielle samfunn. Mikroskopitelling ved høy temporal oppløsning i et dedikert område brukes til å skaffe BTC i den PDMS-baserte mikrofluidiske enheten. For å få celletellinger for BTC-modellering fra den PMMA-baserte enheten, introduserer vi en selvkonstruert automatisert væskedispenser i kombinasjon med strømningscytometri. I dette oppsettet passerer cellene den fluidiske enheten og blir etterfølgende dispensert i 96 brønnplater. Den timelige oppløsningen er begrenset av minimumsvolumet som kan dispenseres nøyaktig og dermed middels strømningshastighet gjennom den fluidiske enheten. Fikseringsmiddel i brønnene forhindrer vekst og letter DNA-farging for nedstrøms strømningscytokometriske opplisting. For å forhindre bakteriell vekst under transporteksperimenter bruker vi en minimal medium (be sikt motilitetsbuffer).

Siden protokoller for fremstilling av fluidiske enheter i forskjellige skalaer er lett tilgjengelige, introduserer vi bare kort teknikkene for å produsere slike enheter og heller fokusere på eksperimentelle prosedyrer for å registrere BTCer. På samme måte finnes det ulike rutiner for flytcytokometrisk opplisting av mikrober og brukere krever ekspertkunnskap for å tolke resultater oppnådd ved strømningscytometri. Vi rapporterer den nye bruken av mikrofluidiske enheter i kombinasjon med mikroskopisk bildebehandling for å registrere BTCer av fluorescerende merkede celler. På poreskalaen oppnås lokale hastigheter og baner ved hjelp av bildebehandling. Videre demonstrerer vi bruken av en PMMA-basert fluidisk enhet i kombinasjon med flow-cytometrisk telling for å observere bakteriell transport av motile og ikke-motile celler i porøse miljøer kolonisert av en innfødt stream biofilm.

Protocol

1. Bakterielle kulturforhold Arbeider under en laminær strømningshette, bruk 100 μL av en glyserol lager av GFP-merket Pseudomonas putida KT2440 (1 × 107 ml-1, lagret ved -80 °C) for å inokulere 5 ml Luria-Bertani (LB) medium. Inkuber ved 30 °C mens du rister ved 250 o/min over natten. Neste dag, resuspend 100 μL av natten kultur i 5 ml LB medium og inkubere under de samme forholdene for 5t (eksponentiell fase). Prøv en 1 ml aliquot inn i en 2 ml rør, la avkjø…

Representative Results

For å illustrere funksjonaliteten til den presenterte arbeidsflyten utførte vi eksperimenter ved hjelp av genmodifiserte Pseudomonas putida KT2440, en gram negativ motil bakterie som er viktig for bioremediering og bioteknologi. Genmodifiserte versjoner av denne stammen som uttrykker GFP-produksjon er kommersielt tilgjengelige. En ikke-motil stamme av P. putida KT2440 som mangler relevante strukturelle og regulatoriske gener for motilitet er også tilgjengelig. Ved hje…

Discussion

Her foreslår vi to måter å studere transport av mikrober gjennom porøse systemer på encellet og befolkningsnivå. Mens studien av transportfenomener ved hjelp av BTC-modellering har gitt verdifull innsikt i spredningen av patogener eller forurensninger på økosystemskalaene, eksisterer det fortsatt vanskeligheter med å skalere fra laboratorieeksperimenter til feltforhold. Verktøyene som er beskrevet her, gjør det mulig for forskere å eksperimentelt løse de romlige og timelige skalaene for å bedre forstå mikr…

Materials

EDTA	Sigma
Elastomer Sylgard 184	Dowsil	101697
Flow cytometer NovoCyte	Acea
Glucose	Sigma		https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit
LB broth	BD
Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit	makeblock
Microscope Axio Imager	Zeiss
Microscope AxioZoom v16	Zeiss
Microscope slides, 75 mm × 25 mm	Corning
Minipuls 3 peristaltic pump	Gilson
Plasma bonder Corona SB	BlackHole Lab
Potassium phosphate	Sigma
Syringe pump New Era NE 4000	New Era
Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain	Molecular Probes, Invitrogen
Tygon tubing	Ismatec
WF31SA universal milling machine	Mikron