Análisis de la cadena de ubiquitina por monitoreo paralelo de reacciones
Summary
Este método describe la evaluación de los cambios globales en la topología de la cadena de ubiquitina. La evaluación se realiza mediante la aplicación de un enfoque proteómico específico basado en espectrometría de masas.
Abstract
La evaluación del perfil global de las topologías de la cadena de ubiquitina dentro de un proteoma es de interés para responder a una amplia gama de preguntas biológicas. El protocolo descrito aquí aprovecha la modificación di-glicina (-GG) que queda después de la digestión tríptica de ubiquitina incorporada en una cadena. Al cuantificar estos péptidos de topología-característica se puede determinar la abundancia relativa de cada topología de cadena de ubiquitina. Los pasos necesarios para cuantificar estos péptidos mediante un experimento paralelo de monitoreo de reacciones se informan teniendo en cuenta la estabilización de las cadenas de ubiquitina. La preparación de controles pesados, lisis celular y digestión se describen junto con el flujo de trabajo adecuado de configuración de espectrómetros de masas y análisis de datos. Se presenta un conjunto de datos de ejemplo con perturbaciones en la topología de ubiquitina, acompañado de ejemplos de cómo la optimización del protocolo puede afectar a los resultados. Siguiendo los pasos descritos, un usuario podrá realizar una evaluación global del panorama de la topología de ubiquitina dentro de su contexto biológico.
Introduction
La estrecha regulación de la función y estabilidad de las proteínas es de suma importancia, ya que son los principales impulsores del control fenotípico de la biología. La función de una proteína se construye a partir de dos componentes: su secuencia intrínsa de polipéptidos y cualquier modificación posttranslacional (PTM). Se han identificado varios PTMs químicos, incluyendo glicosilación, fosforilación, acetilación y metilación1. En 1975, Goldstein et al.2 identificaron una pequeña proteína y la llamaron ubiquitina debido a su naturaleza omnipresente. Se encontró que la ubiquitina era importante en la degradación deproteínas 3. Sin embargo, desde entonces se ha establecido que la función de la ubiquitina como molécula de señalización se extiende mucho más allá de la regulación de la estabilidad de las proteínas. La señalización de ubiquitina participa en una amplia gama de otras funciones biológicas, como la estabilización de proteínas, la autofagia, el control del ciclo celular y el tráfico de proteínas4.
Mientras que otros PTMs son generalmente binarios (es decir, la proteína se modifica o se deja sin modificar) para un sitio dado, la ubiquitina puede modificar una proteína tanto como monómero como como una cadena polimérica, con la ubiquitina adjunta en sí siendo ubiquitina. Además, esta cadena de poliubiquitinación puede desarrollarse en varias topologías con la ubiquitinación de la ubiquitina anterior que se une a uno de los ocho sitios de eslabones5,6. La ubiquitina se transfiere mediante un proceso enzimático multipaso(Figura 1)donde la C-terminus de ubiquitina está vinculada a uno de sus siete residuos de lisina (K06, K11, K27, K29, K33, K48 o K63) o al N-terminal de la ubiquitina anterior (denominada ubiquitina M1 o lineal)5,6. Esta topología de cadena es clave para el destino de la proteína bajo modificación. Por ejemplo, la modificación con una cadena vinculada K48 o K11 conduce a la degradación de la proteína modificada en el proteasoma, mientras que una cadena lineal es necesaria para la activación de la señalización NF-kB. Por lo tanto, la distribución relativa de estas topologías de cadena es relevante para una amplia variedad de cuestiones biológicas.
El uso de espectrometría de masas (EM) es de particular beneficio para el análisis de topología de cadena de ubiquitina, ya que no depende de interacciones basadas en anticuerpos o basadas en afinidad7,8, muchas de las cuales tienen una especificidad limitada y no diferencian entre los distintos tipos de cadena. Una posibilidad de detección diferente es el uso de mutantes de ubiquitina genéticamente modificados. Aquí, una lisina específica se intercambia por arginina, que no puede soportar la modificación por ubiquitina. La falta de formación de cadena de ubiquitina en la proteína del sustrato se interpreta entonces como evidencia de una topología específica9.
La identificación basada en EM de proteínas ubiquitinadas se basa en el hecho de que la C-terminus de ubiquitina contiene un residuo de arginina en la posición 74 que es reconocido por la trippsina durante la preparación proteótica de las muestras para el análisis de EM, separando el doble glicina C-terminal. Este GlyGly (-GG) permanece unido al grupo ε-amino de los residuos de lisina de la proteína del sustrato. Para el análisis de topología de ubiquitina, la modificación se produce en uno de los siete residuos de lisina de ubiquitina. Esto crea un conjunto de siete péptidos clave que llevan un residuo de lisina modificado por GG, específico para cada una de las topologías (Figura 2). Por ejemplo, con la topología K06, la lisina en la posición 6 en la secuencia de aminoácidos estará protegida de la digestión tríptica con una modificación -GG de 114 Da añadida a esta lisina.
La identificación de péptidos predeterminados específicos por EM se conoce como proteómica dirigida, o más específicamente, adquisición de péptidos dirigidos10. Se han desarrollado dos métodos dependiendo del rendimiento del espectrómetro de masas que se está utilizando. Estos son monitoreo de reacción seleccionado (SRM), también llamado monitoreo de reacción múltiple (MRM), y monitoreo de reacción paralelo (PRM). SRM implica la selección de transiciones que consisten en el precursor m/z y el producto iónico m/z. Por el contrario, PRM requiere sólo el precursor m/z. Después de la selección, se realiza un análisis completo de la encuesta de los iones del producto. Esto tiene la ventaja de que no es necesaria ninguna selección de iones de producto adecuados para la cuantificación en el espectrómetro de masa específico antes de la medición11. Tanto SRM como PRM pueden, dependiendo del instrumento, ser programados. La programación es la práctica de asignar una ventana de tiempo durante la cual se incluirá un ión determinado para su análisis, ya que los péptidos se eluden en los momentos de retención definidos del sistema cromatógráfico. Reducir el número de iones que se interroguen en un momento dado aumenta la frecuencia de interrogatorio de esos iones programados en ese momento, mejorando así la precisión de los datos.
En general, la aplicación de proteómica dirigida para la topología de ubiquitina es la misma que cualquier otro experimento proteómico dirigido. Sin embargo, dos diferencias clave son importantes: En primer lugar, debe considerarse la estabilidad de las cadenas de ubiquitina. Hay múltiples enzimas desubiquitinantes potentes (DUB) que degradan rápidamente las cadenas sobre la lisis celular. Los proteases específicos de la ubiquitina se dividen en dos categorías, las tioesteras y las metaloproteases. La mayoría de las ubiquitina-hidrolasas son tioesteras y transportan un residuo de cisteína en su centro activo. Al alquilar estos residuos de cisteína, se pueden desactivar. Como tal, el uso de búferes de estabilización de ubiquitina que contienen agentes alquilantes, como N-ethylmaleimide (NEM), y productos químicos altamente desnaturalizadores, y mantener las muestras frías es vital para un análisis exitoso. En segundo lugar, a diferencia de otros experimentos dirigidos, la elección del péptido es fija. En un experimento dirigido típico, se puede seleccionar un péptido proteotípico para un buen rendimiento cromatómico e ionización. Para algunos péptidos de características de topología como K48 estas propiedades son buenas, mientras que para otros, son menos deseables. Por ejemplo, la cromatografía K33 en una configuración típica en fase inversa es deficiente debido a la formación de un perfil de elución estirado, y las malas propiedades de ionización del péptido K27 reducen su visibilidad en MS12.
En este protocolo, describimos cómo realizar la evaluación de topología de ubiquitina de una muestra biológica por PRM. Los datos de ejemplo para el procedimiento se presentan utilizando una perturbación del proteasoma utilizando el tratamiento inhibidor de MG-132 en varios tipos de células diferentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
El análisis del estado de ubiquitina dentro de un proteoma es de creciente importancia para una amplia variedad de cuestiones biológicas. La descripción del estado de ubiquitinación de una muestra debe centrarse no sólo en el perfil de las proteínas que se ubicuan, sino también en la topología de dicha ubiquitinación. La evaluación de esta topología por EM dirigida, como se describe aquí, tiene un papel en una amplia gama de investigaciones biológicas.
Debe entenderse que el proto…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores quieren agradecer a Céline Jeanty su ayuda en la creación de pellets celulares con tratamiento de MG-132 como se describe en los resultados representativos y a Elise Mommaerts por su provisión de pellets E. coli utilizados en el protocolo.
Materials
| Acetonitrile (ACN) | Merck | 100029 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | Fluka | 9830 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 16 | |
| Chloroacetamide (CAA) | Sigma | 22790 | |
| Eppendorf LoBind | Eppendorf | 22431081 | |
| Formic acid (FA) | Thermo Fisher Scientific | 85178 | |
| Heavy Peptides | JPT Peptide Technologies | ||
| HPLC | Dionex | Ulitimate 3000 | |
| LC Column | Thermo Fisher Scientific | 160321 | |
| Lys C | Wako | 125-05061 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q-Exactive Plus | |
| N-ethylmaleimide (NEM) | ACROS Organics | 156100050 | |
| Positive Control Chain K48 | Boston Biochem | UC-240 | |
| Positive Control Chain K63 | Boston Biochem | UC-340-100 | |
| Positive Control Chain M1 | Boston Biochem | UC-710B-025 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S5881 | |
| Sonifier | Branson sonifier | SFX 150 | |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigam | T6508 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Thermo Fisher Scientific | 77720 | |
| Trypsin | Promega | V1511A | |
| Urea | Sigma | 51456 | |
| Waters μElution C18 plates | Waters | 186002318 |
Referências
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