Ubiquitin kedjeanalys genom parallell reaktionsövervakning
Summary
Denna metod beskriver bedömningen av globala förändringar i ubiquitin kedjan topologi. Bedömningen utförs genom tillämpning av en masspektrometri-baserad riktad proteomics strategi.
Abstract
Bedömning av den globala profilen av ubiquitin kedjan topologies inom en proteome är av intresse att svara på ett brett spektrum av biologiska frågor. Protokollet som beskrivs här drar nytta av di-glycin (-GG) modifieringen kvar efter tryptisk matsmältning av ubiquitin införlivas i en kedja. Genom att kvantifiera dessa topologi-karakteristiska peptider kan det relativa överflöd av varje ubiquitin kedja topologi bestämmas. De åtgärder som krävs för att kvantifiera dessa peptider genom ett parallellt reaktionsövervakningsexperiment rapporteras med hänsyn till stabiliseringen av ubiquitinkedjor. Förberedelse av tunga kontroller, celllys och matsmältning beskrivs tillsammans med lämplig masspektrometerinställning och dataanalysarbetsflöde. Ett exempel på datauppsättning med oro i allestädes närvarande topologi presenteras, tillsammans med exempel på hur optimering av protokollet kan påverka resultaten. Genom att följa de steg som beskrivs kommer en användare att kunna utföra en global bedömning av det allestädes närvarande topologilandskapet i sitt biologiska sammanhang.
Introduction
Den nära regleringen av proteinfunktion och stabilitet är av största vikt, eftersom de är viktiga drivkrafter för fenotypisk kontroll av biologi. Ett proteins funktion är konstruerad av två komponenter: dess inneboende polypeptidsekvens och eventuella posttranslational modifieringar (PTMs). Olika kemiska PTMs har identifierats inklusive glykosylering, fosforylering, acetylering och metylering1. År 1975 identifierade Goldstein et al.2 ett litet protein och döpte det till allestädes närvarande på grund av dess allestädes närvarande natur. Ubiquitin konstaterades vara viktigt vid proteinnedbrytning3. Men sedan dess har det fastställts att ubiquitins funktion som signalmolekyl sträcker sig långt bortom regleringen av proteinstabilitet. Ubiquitin signalering är involverad i ett brett spektrum av andra biologiska funktioner, såsom proteinstabilisering, autofagi, cellcykelkontroll och proteinhandel4.
Medan andra PTMs i allmänhet är binära (dvs. proteinet modifieras eller lämnas omodifierat) för en viss plats, kan ubiquitin modifiera ett protein både som monomer eller som en polymerisk kedja, med den bifogade ubiquitin själv allestädes närvarande. Vidare kan denna polyubiquitination kedja utvecklas i flera topologies med ubiquitination av den tidigare allestädes närvarande fästa vid en av åtta länkplatser5,6. Ubiquitin överförs genom en multistep enzymatisk process(figur 1) där ubiquitins C-ändstation är kopplad till en av dess sju lysinrester (K06, K11, K27, K29, K33, K48 eller K63) eller N-terminalen för den tidigare allestädes närvarande (kallad M1 eller linjär ubiquitination)5,6. Denna kedjetopologi är nyckeln till proteinet under modifiering. Till exempel leder modifieringen med en K48- eller K11-länkad kedja till nedbrytning av det modifierade proteinet vid proteasomen, medan en linjär kedja är nödvändig för aktivering av NF-kB-signalering. Således är den relativa fördelningen av dessa kedje-topologies relevant för en mängd olika biologiska frågor.
Användningen av masspektrometri (MS) är särskilt till nytta för ubiquitin kedjetopologi analys eftersom det inte är beroende av antikroppsbaserade eller affinitet-baserade interaktioner7,8, varav många har begränsad specificitet och skiljer inte mellan de olika kedjetyperna. En annan detektionsmöjlighet är att använda genetiskt modifierade ubiquitinmutanter. Här utbyts ett specifikt lysin mot arginin, som inte kan stödja modifieringen av ubiquitin. Bristen på ubiquitin kedjebildning på substratproteinet tolkas sedan som bevis för en specifik topologi9.
MS-baserad identifiering av allestädes närvarande proteiner baseras på det faktum att C-ändstationen av ubiquitin innehåller en arginin rester i position 74 som känns igen av trypsin under proteolytisk beredning av proverna för MS analys, separera C-terminal dubbel glycin. Denna GlyGly (-GG) förblir fäst vid ε-aminogruppen av lysinresterna i substratproteinet. För ubiquitin topologi analys sker modifieringen på en av de sju lysin resterna av ubiquitin. Detta skapar en uppsättning av sju viktiga peptider som bär en lysinrester som modifieras av GG, specifik för var och en av topologies (Figur 2). Till exempel, med K06 topologi, lysinet på position 6 på aminosyrasekvensen kommer att skyddas från tryptisk matsmältning med en -GG-modifiering av 114 Da läggs till detta lysin.
Identifiering av specifika förutbestämda peptider av MS kallas riktad proteomik, eller mer specifikt riktat peptidförvärv10. Två metoder har utvecklats beroende på masspektrometerns prestanda. Dessa är utvalda reaktionsövervakning (SRM), även kallad multipla reaktionsövervakning (MRM) och parallell reaktionsövervakning (PRM). SRM innebär val av övergångar bestående av föregångaren m/z och produkten jon m/z. Omvänt kräver PRM endast föregångaren m/z. Efter valet utförs en fullständig undersökning av produktjonerna. Detta har fördelen att inget urval av lämpliga produktjoner för kvantifiering på den specifika masspektrometern är nödvändigt före mätningen11. Både SRM och PRM kan, beroende på instrumentet, schemaläggas. Schemaläggning är praxis att tilldela ett tidsfönster under vilket en viss jon kommer att inkluderas för analys, eftersom peptider eluerar vid definierade retentionstider från det kromatografiska systemet. Att minska antalet joner som förhörs vid en viss tidpunkt ökar frekvensen av förhör av de joner som planeras vid den tidpunkten, vilket förbättrar datanoggrannheten.
I allmänhet är tillämpningen av riktade proteomik för ubiquitin topologi samma som alla andra riktade proteomics experiment. Två viktiga skillnader är dock viktiga: För det första måste stabiliteten hos ubiquitinkedjor beaktas. Det finns flera potenta deubiquitinating enzymer (DUB) som snabbt försämrar kedjor på cell lys. De allestädes närvarande proteaserna tillhör två kategorier, thioesterases och metalloproteases. De flesta av ubiquitin-hydrolaserna är thioesteraser och bär en cysteinrester i sitt aktiva centrum. Genom att alkylera denna cysteinrester kan de inaktiveras. Som sådan är användningen av ubiquitin stabiliseringsbuffertar som innehåller alkylerande medel, som N-etylmaleimid (NEM), och mycket denaturerande kemikalier, och att hålla prover kylda avgörande för en framgångsrik analys. För det andra, till skillnad från andra riktade experiment, är peptidvalet fixat. I ett typiskt riktat experiment kan en proteotypisk peptid väljas för god kromatografisk och joniseringsprestanda. För vissa topologi-karakteristiska peptider som K48 är dessa egenskaper bra, medan de för andra är mindre önskvärda. Till exempel är K33-kromatografin i en typisk omvänd fasinställning dålig på grund av bildandet av en sträckt elueringsprofil, och de dåliga joniseringsegenskaperna hos K27-peptiden minskar sikten med MS12.
I detta protokoll beskriver vi hur man utför ubiquitin topologi bedömning av ett biologiskt prov av PRM. Exempeldata för förfarandet presenteras med hjälp av en stör av proteasomen med MG-132-hämmarbehandling i flera olika celltyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analys av ubiquitin staten inom en proteome är av ökande betydelse för en mängd olika biologiska frågor. Beskrivningen av ett provs allestädes närvarande tillstånd måste inte bara fokusera på profilen av proteiner som är allestädes närvarande utan också på topologin för sådan allestädes närvarande. Bedömningen av denna topologi av riktade MS, som beskrivs här, har en roll i ett brett spektrum av biologiska undersökningar.
Det bör förstås att det protokoll som beskrivs …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Céline Jeanty för hennes hjälp med att skapa cellulära pellets med behandling av MG-132 som beskrivs i de representativa resultaten och Elise Mommaerts för hennes tillhandahållande av E. coli pellets som används i protokollet.
Materials
| Acetonitrile (ACN) | Merck | 100029 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | Fluka | 9830 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 16 | |
| Chloroacetamide (CAA) | Sigma | 22790 | |
| Eppendorf LoBind | Eppendorf | 22431081 | |
| Formic acid (FA) | Thermo Fisher Scientific | 85178 | |
| Heavy Peptides | JPT Peptide Technologies | ||
| HPLC | Dionex | Ulitimate 3000 | |
| LC Column | Thermo Fisher Scientific | 160321 | |
| Lys C | Wako | 125-05061 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q-Exactive Plus | |
| N-ethylmaleimide (NEM) | ACROS Organics | 156100050 | |
| Positive Control Chain K48 | Boston Biochem | UC-240 | |
| Positive Control Chain K63 | Boston Biochem | UC-340-100 | |
| Positive Control Chain M1 | Boston Biochem | UC-710B-025 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S5881 | |
| Sonifier | Branson sonifier | SFX 150 | |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigam | T6508 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Thermo Fisher Scientific | 77720 | |
| Trypsin | Promega | V1511A | |
| Urea | Sigma | 51456 | |
| Waters μElution C18 plates | Waters | 186002318 |
Referências
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90 (2011).
- Goldstein, G., et al. Isolation of a polypeptide that has lymphocyte-differentiating properties and is probably represented universally in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (1), 11-15 (1975).
- Glickman, M. H., Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: Destruction for the sake of construction. Physiol. Rev. 82, 373-428 (2002).
- Pickart, C. M., Eddins, M. J. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1695 (1-3), 55-72 (2004).
- Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. Ubiquitin chain diversity at a glance. Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).
- Komander, D., Rape, M. The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).
- Mattern, M., Sutherland, J., Kadimisetty, K., Barrio, R., Rodriguez, M. S. Using Ubiquitin Binders to Decipher the Ubiquitin Code. Trends in Biochemical Sciences. 44 (7), 599-615 (2019).
- Newton, K., et al. Ubiquitin chain editing revealed by polyubiquitin linkage-specific antibodies. Cell. 134 (4), 668-678 (2008).
- Spence, J., et al. Cell cycle-regulated modification of the ribosome by a variant multiubiquitin chain. Cell. 102 (1), 67-76 (2000).
- Borràs, E., Sabidó, E. What is targeted proteomics? A concise revision of targeted acquisition and targeted data analysis in mass spectrometry. PROTEOMICS. 17 (17-18), (2017).
- Lesur, A., Domon, B. Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics. PROTEOMICS. 15 (5-6), 880-890 (2015).
- Longworth, J., Dittmar, G. Assessment of Ubiquitin Chain Topology by Targeted Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1977, 25-34 (2019).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
- Tawa, N. E., Odessey, R., Goldberg, A. L. Inhibitors of the proteasome reduce the accelerated proteolysis in atrophying rat skeletal muscles. The Journal of Clinical Investigation. 100 (1), 197-203 (1997).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
- MacLean, B., et al. Effect of Collision Energy Optimization on the Measurement of Peptides by Selected Reaction Monitoring (SRM) Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (24), 10116-10124 (2010).
