Fuldt forarbejdet rekombinant KRAS4b: isolering og karakterisering af det Farnesylerede og methylerede protein
Summary
Prenylation er en vigtig modifikation på ydre membran bindende proteiner. Insekt celler kan manipuleres til fremstilling af farnesylerede og carboxymethylerede KRAS4b i mængder, der muliggør biofysiske målinger af protein-protein-og protein-lipid-interaktioner
Abstract
Protein prenylation er en vigtig modifikation, der er ansvarlig for at målrette proteiner til intracellulære membraner. KRAS4b, som er muteret i 22% af de menneskelige kræftformer, behandles ved farnesylering og carboxymethylering på grund af tilstedeværelsen af et ‘ CAAX ‘ boks motiv ved C-terminalen. En konstrueret og system blev brugt til at udtrykke farnesylated og carboxymethylated KRAS4b i insekt celler og er blevet beskrevet tidligere. Her beskriver vi den detaljerede, praktiske rensning og biokemiske karakterisering af proteinet. Specifikt, affinitet og ionbytningskromatografi blev brugt til at rense proteinet til homogenitet. Intakt og Native massespektrometri blev anvendt til at validere den korrekte modifikation af KRAS4b og til at verificere nukleotidbinding. Endelig blev membran Association af farnesylated og carboxymethylated KRAS4b til Liposomer målt ved hjælp af overflade Plasmon resonansspektroskopi.
Introduction
Posttranslationelle modifikationer spiller en central rolle i definitionen af proteiners funktionelle aktivitet. Ændringer såsom fosforylering og glykosylering er veletablerede. Lipid modifikationer er mindre velkarakteriseret, dog. Det anslås, at så meget som 0,5% af alle cellulære proteiner kan være prenylated1. Prenylation er overførslen af en 15-Carbon at eller en 20-Carbon geranylgeranyl lipid kæde til en acceptor protein, der indeholder caax Motif2. Prenylated proteiner har været impliceret i progression af flere menneskelige sygdomme, herunder for tidlig aldring3, Alzheimers4, kardiel dysfunktion5, choroideremia6, og kræft7. De små GTPases, HRAS, NTM og KRAS1, nukleare lamininer og kinetochores cenp-E og F er farnesylerede proteiner under basal tilstand. Andre små GTPases, nemlig RhoA, RhoC, Rac1, CDC-42, og RRAS er geranylgeranylated8, hvorimod rhob kan være farnesylated eller geranylgeranylated9.
Den lille GTPase KRAS4b fungerer som en molekylær switch, hovedsagelig sender ekstracellulære vækstfaktor signalering til intracellulære signal transduktionsveje, der stimulerer cellevækst og spredning, via flere protein-protein interaktioner. Der er to centrale aspekter af KRAS4b biokemi, der er afgørende for dens aktivitet. For det første er protein cyklusserne mellem et inaktivt BNP og en aktiv GTP-bundet tilstand, hvorved det aktivt engagerer sig i effektorer. For det andet dirigere en C-terminale poly-lysin-region og en farnesyleret og carboxymethyleret cystein direkte proteinet til plasma membranen, hvilket muliggør rekruttering og aktivering af downstream-effektorer. Mutant KRAS4b er en onkogene driver i bugspytkirtlen, kolorektal, og lungekræft10, og som sådan, terapeutisk intervention ville have en enorm klinisk fordel. Fremstilling af autentisk modificeret rekombinant protein, der er farnesyleret og carboxymethyleret, vil muliggøre biokemisk screening ved hjælp af KRAS4b i kombination med membran surrogater såsom Liposomer eller lipid nanodiske11,12.
Farnesyltransferase (FNT) katalyserer tilsætning af at-pyrophosphat til C-terminalens cystein i caax-motivet i KRAS4b. Efter prenylering handles proteinet til endoplasmatiske reticulum (er), hvor RAS-konverterende enzym (RCE1) kløver de tre C-terminale rester. Det sidste trin i forarbejdningen er methylering af den nye C-Terminal farnesylcystein rest af ER membran protein, isoprenylcystein carboxylgrupper methyltransferase (ICMT). Udtryk for rekombinant KRAS4b i E. coli resulterer i produktion af et umodificeret protein. Tidligere forsøg på at producere forarbejdede KRAS4b har været begrænset på grund af utilstrækkelige udbytter for strukturelle eller Drug screening forsøg eller har undladt at rekapitulere den indfødte fuld længde modne protein13,14. Protokollen præsenteres her udnytter en manipuleret baculovirus-baserede insekt celle ekspressionssystem og rensning metode, der genererer højt renset, fuldt forarbejdet KRAS4b på udbytter af 5 mg/L cellekultur.
Omhyggelig protein karakterisering er afgørende for at validere kvaliteten af rekombinante proteiner forud for påbegyndelse af strukturel biologi eller Drug screening undersøgelser. To nøgleparametre for fuldt forarbejdet KRAS4b er validering af den korrekte prenyl modifikation og tilgængeligheden af farnesylated og carboxymethylated C-Terminus (FMe) for interaktion med membran erstatninger eller lipider. Elektro spray ioniserings massespektrometri (ESI-MS) af KRAS4b-FME blev anvendt til at måle molekylvægten og bekræfte tilstedeværelsen af at-og natriumcarboxymethylcellulose-modifikationer. Native massespektrometri, hvor prøverne sprøjtes med ikke-denatureringsmidler, blev brugt til at påvise, at KRAS4b-FMe også var bundet til sin BNP-cofactor. Endelig blev overflade Plasmon resonansspektroskopi anvendt til at måle den direkte binding af KRAS4b-FMe med immobiliserede Liposomer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som nævnt i afsnittet om repræsentative resultater er det mest kritiske trin i rensningen håndteringen af prøven i den tid, det er i lavere salt. Begrænse den tid, at prøven er udsat for mindre end 200 mM NaCl vil bidrage til at reducere nedbør og øge prøve udbyttet. Det kan være vanskeligt at fortolke resultaterne af CEX, hvis profilen ikke svarer til forventningerne (Se figur 2). Indtil protokollen er blevet rutine, tilrådes det, at CEX elueringsfraktioner, der ikke videreføres…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender kloning og ekspression støtte fra Carissa Grose, Jen Melhalko, og Matt Drew i protein ekspression laboratorium, Frederick nationale laboratorium for kræftforskning. Dette projekt er blevet finansieret helt eller delvist med føderale midler fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, under kontrakt nr. HHSN261200800001E. Indholdet af denne publikation ikke nødvendigvis afspejler de synspunkter eller politikker af Department of Health and Human Services, heller ikke nævner handelsnavne, kommercielle produkter, eller organisationer indebærer godkendelse af den amerikanske regering
Materials
| 1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural | Eppendorf | 22363204 | |
| 11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials | Thermo Scientific | 30211SS-1232 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | AVANTI POLAR LIPIDS | 850457 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) | AVANTI POLAR LIPIDS | 840034 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 5427R Centrifuge | Eppendorf | ||
| Acetonitrile, HPLC Grade | Fisher Chemical | A998-1 1L | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 09689-250g | |
| Argon gas | Airgas | ARUP | |
| Assay Plate 384 | CORNING | 3544 | |
| Biacore T200 Instrument | GE Healthcare | ||
| Blue Snap-It Seals, T/S | Thermo Scientific | C4011-54B | |
| Branson Ultrasonic Bath | Thermo Fisher | 15-336-1000 | |
| Cation Exchange Chromatography (CEX) column | GE Healthcare Life Sciences | 29018183 | HiPrep SP Sepharose High Performance |
| CHAPS | Sigma | C3023 | |
| Dyna Pro Plate Reader | Wyatt Technologies | ||
| Exactive Plus EMR Mass Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500Ml | Use Reagent Grade or better |
| Gilson vials 7×14 mm Tubes | GE Healthcare | BR-1002-12 | |
| Glass screw thread vials with PTFE foam liners | Scientific Specialities | B69302 | |
| High speed/benchtop centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 05-112-114D | capable of up to 4,000 xg |
| His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease | Addgene | 92414 | Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY |
| Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column | GE Healthcare Life Sciences | 28-9365-51 | HisPrep FF 16/10 |
| In-House Water Supply, Arium Advance | Sartorius Stedim | Resistivity of 18 MΩ0-cm | |
| Lipid extruder set with holder | AVANTI POLAR LIPIDS | 610023 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI-DEWAR | |
| M110-EH microfluidizer | Microfluidics | ||
| MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm | Thermo Scientific | 088645 | |
| MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 Å, 2.1 x 150 mm | Thermo Scientific | 088790 | |
| MagTran software | Thermo Scientific | ||
| Methanol, HPLC Grade | VWR Chemicals | BDH20864.400 | |
| NGC Chromatography System | BioRad | 78880002 | NGC QuestTM 100 Chromatography system |
| Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators | Millipore Sigma | P8849 | |
| Rubber Caps type 3 | GE Healthcare | BR-1005-02 | |
| Series S Sensor Chip L1 | GE Healthcare | 29104993 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | 13-400-519 | Absorbace at 280nm |
| Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL | Millipore Sigma | UFC901008 | PES membrane |
| Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters | Amicon | UFC501024 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima – L80K | capable of 100,000 xg |
| Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System) | Thermo Scientific | ||
| Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | |
| Water, HPLC Grade | Sigma-Aldrich | 270733-1L | May use in-house water source (see below) |
| Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter | GE Healthcare – Whatman | 6994-2504 | |
| Xcalibur QualBrowser | Thermo Scientific | proteomics software |
Referências
- Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
- Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).
- Hottman, D. A., Li, L. Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer’s disease. Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).
- Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. HDL and cognition in neurodegenerative disorders. Neurobiology of Disease. 72, 22-36 (2014).
- Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms. Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).
- Kohnke, M., et al. Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease. PLoS One. 8 (12), 81758 (2013).
- Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. Targeting protein prenylation for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).
- Kho, Y., et al. A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).
- Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).
- Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. Dragging ras back in the ring. Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).
- Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics. Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).
- Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles. Journal of Visualized Experiments. (66), e3910 (2012).
- Dementiev, A. K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation. Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).
- Lowe, P. N., et al. Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems. Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).
- Gillette, W., et al. Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System. Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).
- Agamasu, C., et al. KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner. Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).
- Talsania, K., et al. Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies. Genes. 10 (2), 79 (2019).
- Spencer-Smith, R., et al. Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site. Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).
- Lowe, P. N., et al. Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system. Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).
- Dharmaiaha, S., et al. Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDEδ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).
- Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore. Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).
- Fisher, R. J., et al. Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).
- Lakshman, B., et al. Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).
