KRAS4b recombinant entièrement transformé : Isoler et caractériser les protéines farnestées et méthylées
Summary
La prénylation est une modification importante sur les protéines de liaison de membrane périphérique. Les cellules d’insectes peuvent être manipulées pour produire des KRAS4b farnédées et carboxyméthylées en quantités qui permettent des mesures biophysiques des interactions protéines-protéines et protéines-lipides
Abstract
La prénylation des protéines est une modification clé qui est responsable du ciblage des protéines vers les membranes intracellulaires. KRAS4b, qui est muté dans 22% des cancers humains, est traité par farnesylation et carboxymethylation en raison de la présence d’un motif de boîte ‘CAAX’ au terminus C. Un système de baculovirus machiné a été employé pour exprimer kraS4b farnésylated et carboxymethylated dans des cellules d’insecte et a été décrit précédemment. Ici, nous décrivons la purification détaillée et pratique et la caractérisation biochimique de la protéine. Plus précisément, l’affinité et la chromatographie d’échange d’ions ont été utilisées pour purifier la protéine à l’homogénéité. La spectrométrie de masse intacte et indigène a été utilisée pour valider la modification correcte de KRAS4b et pour vérifier la liaison nucléotide. Enfin, l’association de membrane de KRAS4b farnesylated et carboxymethylated aux liposomes a été mesurée utilisant la spectroscopie de résonance de plasmon de surface.
Introduction
Les modifications post-traductionnelle jouent un rôle clé dans la définition de l’activité fonctionnelle des protéines. Les modifications telles que la phosphorylation et la glycosylation sont bien établies. Les modifications lipidiques sont moins bien caractérisées, cependant. On estime que jusqu’à 0,5 % de toutes les protéines cellulaires peuvent être prénylées1. La prénylation est le transfert d’un farnesyl de 15 carbone ou d’une chaîne lipidique geranylgeranyl de 20 carbone à une protéine accepteur contenant le motif CAAX2. Les protéines prénylées ont été impliquées dans la progression de plusieurs maladies humaines, y compris le vieillissement prématuré3, Alzheimer4, dysfonction cardiaque5, chorroideremia6, et le cancer7. Les petits GTPases, HRAS, NRAS et KRAS1, les laminins nucléaires, et les kinétochores CENP-E et F sont des protéines farnédylated sous l’état basal. D’autres petits GTPases, à savoir RhoA, RhoC, Rac1, cdc-42, et RRAS sont geranylgeranylated8, tandis que RhoB peut être farnétatif ou geranylgeranylated9.
Le petit GTPase KRAS4b fonctionne comme un interrupteur moléculaire, transmettant essentiellement le facteur de croissance extracellulaire signalant aux voies intracellulaires de transduction de signal qui stimulent la croissance et la prolifération de cellules, par l’intermédiaire des interactions multiples de protéine-protéine. Il y a deux aspects clés de la biochimie KRAS4b qui sont essentiels à son activité. Tout d’abord, les cycles protéiques entre un PIB inactif et un état lié gtP actif par lequel il s’engage activement avec les effecteurs. Deuxièmement, une région de polylysine C-terminal et une cystéine farnédilate et carboxymethylated dirigent la protéine à la membrane de plasma, permettant le recrutement et l’activation des effecteurs en aval. Mutant KRAS4b est un conducteur oncogène dans le cancer du pancréas, colorectal et du poumon10, et en tant que tel, l’intervention thérapeutique aurait un énorme avantage clinique. La production de protéines recombinantes authentiquement modifiées qui sont farnésylated et carboxymethylated permettrait le criblage biochimique utilisant KRAS4b en combination avec des substituts de membrane tels que des liposomes ou des nanodisques lipidiques11,12.
Farnesyl transferase (FNT) catalyse l’ajout de pyrophosphate de farnesyl à la cystéine C-terminale dans le motif CAAX dans KRAS4b. Après la prénylation, la protéine est trafiquée vers le réticulum endoplasmique (ER) où l’enzyme de conversion Ras (RCE1) fend les trois résidus c-terminaux. La dernière étape dans le traitement est la méthylation du nouveau résidu de farnesylcystéine C-terminal par la protéine de membrane d’ER, isoprenylcysteine carboxyl méthyltransferase (ICMT). L’expression du KRAS4b recombinant dans E. coli entraîne la production d’une protéine non modifiée. Les tentatives précédentes de produire du KRAS4b transformé ont été limitées en raison de rendements insuffisants pour des expériences structurelles ou de dépistage de médicaments ou n’ont pas réussi à récapituler la protéine mature pleine longueur indigène13,14. Le protocole présenté ici utilise un système d’expression et de purification d’insectes à base de baculovirus qui génère un KRAS4b hautement purifié et entièrement traité à des rendements de 5 mg/L de culture cellulaire.
Une caractérisation prudente des protéines est essentielle pour valider la qualité des protéines recombinantes avant de se lancer dans des études de biologie structurelle ou de dépistage des médicaments. Deux paramètres clés du KRAS4b entièrement traité sont la validation de la modification correcte de prenyl et la disponibilité du C-terminus (FMe) farnesylated et carboxymethylated pour l’interaction avec des substituts de membrane ou des lipides. La spectrométrie de masse d’ionisation d’électrospray (ESI-MS) du KRAS4b-FMe a été employée pour mesurer le poids moléculaire et confirmer la présence des modifications de farnesyl et de carboxymethyl. La spectrométrie de masse indigène, où les échantillons sont pulvérisés avec des solvants non dénaturants, a été utilisée pour démontrer que KRAS4b-FMe était également lié à son cofactor de PIB. Enfin, la spectroscopie de résonance de plasmon de surface a été employée pour mesurer la liaison directe de KRAS4b-FMe avec des liposomes immobilisés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comme indiqué dans la section Résultats représentatifs, l’étape la plus critique pendant la purification est la manipulation de l’échantillon pendant le temps qu’il est dans le sel inférieur. Limiter le temps d’exposition de l’échantillon à moins de 200 mM NaCl contribuera à réduire les précipitations et à augmenter le rendement de l’échantillon. L’interprétation des résultats du CEX peut être difficile si le profil ne correspond pas aux attentes (voir la figure 2). Jusqu’à …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons le soutien au clonage et à l’expression de Carissa Grose, Jen Melhalko et Matt Drew du Protein Expression Laboratory, Frederick National Laboratory for Cancer Research. Ce projet a été financé en totalité ou en partie par des fonds fédéraux de l’Institut national du cancer, National Institutes of Health, dans le cadre du contrat no. HHSN261200800001E. Le contenu de cette publication ne reflète pas nécessairement les points de vue ou les politiques du ministère de la Santé et des Services sociaux, et la mention des noms commerciaux, des produits commerciaux ou des organisations n’implique pas nécessairement l’approbation par le gouvernement des États-Unis.
Materials
| 1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural | Eppendorf | 22363204 | |
| 11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials | Thermo Scientific | 30211SS-1232 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | AVANTI POLAR LIPIDS | 850457 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) | AVANTI POLAR LIPIDS | 840034 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 5427R Centrifuge | Eppendorf | ||
| Acetonitrile, HPLC Grade | Fisher Chemical | A998-1 1L | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 09689-250g | |
| Argon gas | Airgas | ARUP | |
| Assay Plate 384 | CORNING | 3544 | |
| Biacore T200 Instrument | GE Healthcare | ||
| Blue Snap-It Seals, T/S | Thermo Scientific | C4011-54B | |
| Branson Ultrasonic Bath | Thermo Fisher | 15-336-1000 | |
| Cation Exchange Chromatography (CEX) column | GE Healthcare Life Sciences | 29018183 | HiPrep SP Sepharose High Performance |
| CHAPS | Sigma | C3023 | |
| Dyna Pro Plate Reader | Wyatt Technologies | ||
| Exactive Plus EMR Mass Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500Ml | Use Reagent Grade or better |
| Gilson vials 7×14 mm Tubes | GE Healthcare | BR-1002-12 | |
| Glass screw thread vials with PTFE foam liners | Scientific Specialities | B69302 | |
| High speed/benchtop centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 05-112-114D | capable of up to 4,000 xg |
| His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease | Addgene | 92414 | Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY |
| Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column | GE Healthcare Life Sciences | 28-9365-51 | HisPrep FF 16/10 |
| In-House Water Supply, Arium Advance | Sartorius Stedim | Resistivity of 18 MΩ0-cm | |
| Lipid extruder set with holder | AVANTI POLAR LIPIDS | 610023 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI-DEWAR | |
| M110-EH microfluidizer | Microfluidics | ||
| MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm | Thermo Scientific | 088645 | |
| MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 Å, 2.1 x 150 mm | Thermo Scientific | 088790 | |
| MagTran software | Thermo Scientific | ||
| Methanol, HPLC Grade | VWR Chemicals | BDH20864.400 | |
| NGC Chromatography System | BioRad | 78880002 | NGC QuestTM 100 Chromatography system |
| Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators | Millipore Sigma | P8849 | |
| Rubber Caps type 3 | GE Healthcare | BR-1005-02 | |
| Series S Sensor Chip L1 | GE Healthcare | 29104993 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | 13-400-519 | Absorbace at 280nm |
| Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL | Millipore Sigma | UFC901008 | PES membrane |
| Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters | Amicon | UFC501024 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima – L80K | capable of 100,000 xg |
| Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System) | Thermo Scientific | ||
| Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | |
| Water, HPLC Grade | Sigma-Aldrich | 270733-1L | May use in-house water source (see below) |
| Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter | GE Healthcare – Whatman | 6994-2504 | |
| Xcalibur QualBrowser | Thermo Scientific | proteomics software |
Referências
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