Vollverarbeitetes rekombinantes KRAS4b: Isoliert und charakterisieren das farnesylierte und methylierte Protein
Summary
Prenylierung ist eine wichtige Modifikation an peripheren Membranbindungsproteinen. Insektenzellen können manipuliert werden, um farnesylierte und carboxymethylierte KRAS4b in Mengen zu produzieren, die biophysikalische Messungen von Protein-Protein- und Protein-Lipid-Wechselwirkungen ermöglichen
Abstract
Proteinpränylierung ist eine wichtige Modifikation, die für die Ausrichtung von Proteinen auf intrazelluläre Membranen verantwortlich ist. KRAS4b, das bei 22% der menschlichen Krebsarten mutiert ist, wird durch Farnesylierung und Carboxymethylierung durch das Vorhandensein eines CAAX-Boxmotivs am C-Terminus verarbeitet. Ein technisches Baculovirus-System wurde verwendet, um farnesylierte und carboxymethylierte KRAS4b in Insektenzellen auszudrücken und wurde zuvor beschrieben. Hier beschreiben wir die detaillierte, praktische Reinigung und biochemische Charakterisierung des Proteins. Insbesondere wurden Affinität und Ionenaustauschchromatographie verwendet, um das Protein auf Homogenität zu reinigen. Intakte und native Massenspektrometrie wurde verwendet, um die korrekte Modifikation von KRAS4b zu validieren und die Nukleotidbindung zu überprüfen. Schließlich wurde die Membranassoziation von farnesylierter und carboxymethylierter KRAS4b zu Liposomen mittels Oberflächen-Plasmonresonanzspektroskopie gemessen.
Introduction
Posttranslationale Modifikationen spielen eine Schlüsselrolle bei der Definition der funktionellen Aktivität von Proteinen. Modifikationen wie Phosphorylierung und Glykosylierung sind gut etabliert. Lipidmodifikationen sind jedoch weniger gut charakterisiert. Es wird geschätzt, dass bis zu 0,5% aller zellulären Proteine pränylatiert sein können1. Pränylierung ist die Übertragung eines 15-Kohlenstoff-Farnesyls oder einer 20-Kohlenstoff-Geranylgeranyl-Lipidkette auf ein Akzeptorprotein, das das CAAX-Motiv2enthält. Pränylate Proteine wurden in das Fortschreiten mehrerer menschlicher Krankheiten verwickelt, einschließlich vorzeitiger Alterung3, Alzheimer4, Herzfunktionsstörungen5, Choroiderämie6und Krebs7. Die kleinen GTPases, HRAS, NRAS und KRAS1, Kernlamine und die Kinetochores CENP-E und F sind farnesylierte Proteine unter dem basalen Zustand. Andere kleine GTPases, nämlich RhoA, RhoC, Rac1, cdc-42 und RRAS sind geranylgeranylated8, während RhoB farnesyliert oder geranylgeranyatd9sein kann.
Der kleine GTPase KRAS4b fungiert als molekularer Schalter und überträgt im Wesentlichen extrazelluläre Wachstumsfaktoren signalet an intrazelluläre Signaltransduktionswege, die das Zellwachstum und die Zellproliferation über mehrere Protein-Protein-Wechselwirkungen stimulieren. Es gibt zwei Schlüsselaspekte der KRAS4b Biochemie, die für ihre Aktivität unerlässlich sind. Erstens, die Proteinzyklen zwischen einem inaktiven BIP und einem aktiven GTP gebundenen Zustand, wobei es aktiv mit Effektoren engagiert. Zweitens leiten eine C-terminale Polylysinregion und ein farnesyliertes und carboxymethyliertes Cystein das Protein auf die Plasmamembran, was die Rekrutierung und Aktivierung nachgeschalteter Effektoren ermöglicht. Mutant KRAS4b ist ein onkogener Treiber bei Bauchspeicheldrüsen-, Dickdarm- und Lungenkrebs10, und als solche, therapeutische Intervention hätte einen großen klinischen Nutzen. Die Herstellung von authentisch modifiziertem rekombinantem Protein, das farnesyliert und carboxymethyliert ist, würde ein biochemisches Screening mit KRAS4b in Kombination mit Membransurrogaten wie Liposomen oder Lipid-Nanoscheibenermöglichen 11,12.
Farnesyltransferase (FNT) katalysiert die Zugabe von Farnesylpyrophosphat zum C-Terminal Cystein im CAAX-Motiv in KRAS4b. Nach der Pränylierung wird das Protein zum endoplasmatischen Retikulum (ER) geschmuggelt, wo das Ras-Converting-Enzym (RCE1) die drei C-Terminal-Rückstände spaltet. Der letzte Schritt in der Verarbeitung ist die Methylierung des neuen C-Terminal-Farnesylcystein-Rückstandes durch das ER-Membranprotein Isoprenylcystein-Carboxylmethyltransferase (ICMT). Die Expression des rekombinanten KRAS4b in E. coli führt zur Produktion eines unveränderten Proteins. Frühere Versuche, verarbeitetes KRAS4b herzustellen, waren aufgrund unzureichender Erträge für Struktur- oder Arzneimittelscreening-Experimente begrenzt oder konnten das native vollwertige ausgereifte Protein13,14nicht rekapitulieren. Das hier vorgestellte Protokoll verwendet ein entwickeltes Baculovirus-basiertes Insektenzellexpressionssystem und Reinigungsmethode, das hochgereinigtes, vollständig verarbeitetes KRAS4b bei einer Ausbeute von 5 mg/L Zellkultur erzeugt.
Eine sorgfältige Proteincharakterisierung ist unerlässlich, um die Qualität rekombinanter Proteine zu validieren, bevor sie mit Strukturbiologie- oder Arzneimittelscreeningstudien beginnen. Zwei wichtige Parameter der vollständig verarbeiteten KRAS4b sind die Validierung der korrekten Pränylmodifikation und die Verfügbarkeit des farnesylierten und carboxymethylierten C-Terminus (FMe) für die Interaktion mit Membranersatzstoffen oder Lipiden. Die Elektrospray-Ionisationsmassenspektrometrie (ESI-MS) des KRAS4b-FMe wurde verwendet, um das Molekulargewicht zu messen und das Vorhandensein der Farnesyl- und Carboxymethylmodifikationen zu bestätigen. Die native Massenspektrometrie, bei der Proben mit nicht denatierenden Lösungsmitteln besprüht werden, wurde verwendet, um zu zeigen, dass KRAS4b-FMe auch an seinen BIP-Kofaktor gebunden war. Schließlich wurde die Oberflächen-Plasmonresonanzspektroskopie verwendet, um die direkte Bindung von KRAS4b-FMe mit immobilisierten Liposomen zu messen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wie im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse erwähnt, ist der wichtigste Schritt während der Reinigung die Handhabung der Probe während der Zeit, in der sie sich in geringerem Salz befindet. Die Begrenzung der Zeit, die die Probe weniger als 200 mM NaCl ausgesetzt ist, trägt dazu bei, die Niederschlagsmenge zu reduzieren und die Probenausbeute zu erhöhen. Die Interpretation der Ergebnisse der CEX kann schwierig sein, wenn das Profil nicht den Erwartungen entspricht (siehe Abbildung 2). B…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir würdigen die Unterstützung des Klonens und der Ausdruckshilfe von Carissa Grose, Jen Melhalko und Matt Drew im Protein Expression Laboratory, Frederick National Laboratory for Cancer Research. Dieses Projekt wurde ganz oder teilweise mit Bundesmitteln des National Cancer Institute, National Institutes of Health, im Rahmen des Vertrags Nr. HHSN261200800001E. Der Inhalt dieser Veröffentlichung spiegelt nicht unbedingt die Ansichten oder Richtlinien des Department of Health and Human Services wider, noch impliziert die Erwähnung von Handelsnamen, kommerziellen Produkten oder Organisationen eine Billigung durch die US-Regierung.
Materials
| 1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural | Eppendorf | 22363204 | |
| 11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials | Thermo Scientific | 30211SS-1232 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | AVANTI POLAR LIPIDS | 850457 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) | AVANTI POLAR LIPIDS | 840034 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 5427R Centrifuge | Eppendorf | ||
| Acetonitrile, HPLC Grade | Fisher Chemical | A998-1 1L | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 09689-250g | |
| Argon gas | Airgas | ARUP | |
| Assay Plate 384 | CORNING | 3544 | |
| Biacore T200 Instrument | GE Healthcare | ||
| Blue Snap-It Seals, T/S | Thermo Scientific | C4011-54B | |
| Branson Ultrasonic Bath | Thermo Fisher | 15-336-1000 | |
| Cation Exchange Chromatography (CEX) column | GE Healthcare Life Sciences | 29018183 | HiPrep SP Sepharose High Performance |
| CHAPS | Sigma | C3023 | |
| Dyna Pro Plate Reader | Wyatt Technologies | ||
| Exactive Plus EMR Mass Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500Ml | Use Reagent Grade or better |
| Gilson vials 7×14 mm Tubes | GE Healthcare | BR-1002-12 | |
| Glass screw thread vials with PTFE foam liners | Scientific Specialities | B69302 | |
| High speed/benchtop centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 05-112-114D | capable of up to 4,000 xg |
| His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease | Addgene | 92414 | Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY |
| Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column | GE Healthcare Life Sciences | 28-9365-51 | HisPrep FF 16/10 |
| In-House Water Supply, Arium Advance | Sartorius Stedim | Resistivity of 18 MΩ0-cm | |
| Lipid extruder set with holder | AVANTI POLAR LIPIDS | 610023 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI-DEWAR | |
| M110-EH microfluidizer | Microfluidics | ||
| MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm | Thermo Scientific | 088645 | |
| MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 Å, 2.1 x 150 mm | Thermo Scientific | 088790 | |
| MagTran software | Thermo Scientific | ||
| Methanol, HPLC Grade | VWR Chemicals | BDH20864.400 | |
| NGC Chromatography System | BioRad | 78880002 | NGC QuestTM 100 Chromatography system |
| Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators | Millipore Sigma | P8849 | |
| Rubber Caps type 3 | GE Healthcare | BR-1005-02 | |
| Series S Sensor Chip L1 | GE Healthcare | 29104993 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | 13-400-519 | Absorbace at 280nm |
| Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL | Millipore Sigma | UFC901008 | PES membrane |
| Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters | Amicon | UFC501024 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima – L80K | capable of 100,000 xg |
| Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System) | Thermo Scientific | ||
| Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | |
| Water, HPLC Grade | Sigma-Aldrich | 270733-1L | May use in-house water source (see below) |
| Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter | GE Healthcare – Whatman | 6994-2504 | |
| Xcalibur QualBrowser | Thermo Scientific | proteomics software |
Referências
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