KRAS4b ricombinante completamente elaborato: isolamento e caratterizzazione delle proteine di Farnesylated e Metylated
Summary
La prenilazione è una modifica importante sulle proteine che legano la membrana periferica. Le cellule degli insetti possono essere manipolate per produrre farnesylated e carboxymethylated KRAS4b in quantità che consentono misurazioni biofisiche delle interazioni proteina-proteina e proteina-lipidi
Abstract
La prenilazione delle proteine è una modifica chiave che è responsabile del targeting delle proteine alle membrane intracellulari. KRAS4b, che è mutato nel 22% dei tumori umani, viene elaborato da farnesilazione e carboxymetilation a causa della presenza di un motivo scatola ‘CAAX’ al capolinea C. Un sistema di baculovirus ingegnerizzato è stato utilizzato per esprimere kraS4b farnesylated e carboxymethylated nelle cellule degli insetti ed è stato descritto in precedenza. Qui descriviamo la purificazione dettagliata e pratica e la caratterizzazione biochimica della proteina. In particolare, l’affinità e la cromatografia di scambio ioleomatico sono stati utilizzati per purificare la proteina per l’omogeneità. La spettrometria di massa intatta e nativa è stata utilizzata per convalidare la corretta modifica di KRAS4b e per verificare l’associazione dei nucleotidi. Infine, l’associazione della membrana di farnesylated e carboxymethylaed KRAS4b ai liposomi è stata misurata utilizzando la spettroscopia della risonanza del plasonanza del plasonco superficiale.
Introduction
Le modifiche post-traduzionali svolgono un ruolo chiave nella definizione dell’attività funzionale delle proteine. Modifiche come il fosfororylazione e la glicosilazione sono ben consolidate. Le modifiche dei lipidi sono tuttavia meno ben caratterizzate. Si stima che per quanto 0.5% di tutte le proteine cellulari possono essere prenylated1. La presilazione è il trasferimento di un farnesyl di 15 carbonio o di una catena di lipidi geranilgeranyl a 20 carbonio a una proteina accettante contenente il motivo CAAX2. Proteine prenylated sono stati implicati nella progressione di diverse malattie umane tra cui l’invecchiamento precoce3, MorbodiAlzheimer 4 , disfunzione cardiaca5, chioderemia6, e cancro7. I piccoli GTPases, HRAS, NRAS e KRAS1, lamininine nucleari, e le cinetocori CENP-E e F sono proteine farnesylated sotto la condizione basale. Altri piccoli GTPases, vale a dire RhoA, RhoC, Rac1, cdc-42 e RRAS sono geranilgeranylated8, mentre RhoB può essere farnesylated o geranylgeranylated9.
Il piccolo GTPase KRAS4b funziona come un interruttore molecolare, essenzialmente trasmettendo fattore di crescita extracellulare che segnala alle vie di trasduzione del segnale intracellulare che stimolano la crescita e la proliferazione cellulare, attraverso molteplici interazioni proteina-proteina. Ci sono due aspetti chiave della biochimica KRAS4b che sono essenziali per la sua attività. In primo luogo, le proteine si scatenano tra un PIL inattivo e uno stato legato gtP attivo in base al quale si impegna attivamente con gli effetti. In secondo luogo, una regione poli-lisina c-terminale e una cisteina farnesillaata e carboxymethylated indirizzano la proteina verso la membrana plasmatica, consentendo il reclutamento e l’attivazione di esedotti a valle. Il kraS4b mutante è un fattore oncogenico nel cancro del pancreas, del colon-retto e del polmone10e, come tale, l’intervento terapeutico avrebbe un enorme beneficio clinico. La produzione di proteine ricombinanti autenticamente modificate che è farnesilata e carboxymethylated consentirebbe lo screening biochimico utilizzando KRAS4b in combinazione con surrogati di membrana come liposomi o nanodischi lipidi11,12.
Farnesyl transferase (FNT) catalizza l’aggiunta di farnesil pirofosfato alla cisteina c-terminale nel motivo CAAX in KRAS4b. Dopo la prenylazione, la proteina viene trafficata al reticolo endoplasmico (ER) dove l’enzima di conversione del ras (RCE1) fende i tre residui del terminale C. L’ultima fase nella lavorazione è la metilazione del nuovo residuo di farnesylcysteine terminale C dalla proteina della membrana ER, isoprenylcysteine carboxyl methyltransferase (ICMT). L’espressione di KRAS4b ricombinante in E. coli determina la produzione di una proteina non modificata. Precedenti tentativi di produrre KRAS4b elaborati sono stati limitati a causa di rese insufficienti per esperimenti di screening strutturale o farmacologico o non sono riusciti a ricapitolare la proteina matura nativa a lunghezza intera13,14. Il protocollo qui presentato utilizza un sistema di espressione delle cellule di insetti a base di baculovirus ingegnerizzato e un metodo di purificazione che genera KRAS4b altamente purificato e completamente elaborato a rese di 5 mg/L di coltura cellulare.
Un’attenta caratterizzazione delle proteine è essenziale per convalidare la qualità delle proteine ricombinanti prima di intraprendere studi di biologia strutturale o di screening farmacologico. Due parametri chiave di KRAS4b completamente elaborati sono la convalida della corretta modifica prenyl e la disponibilità del c-terminus (FMe) farnesylated e carboxymethylated (FMe) per l’interazione con i sostituti della membrana o i lipidi. La spettrometria di massa di ionizzazione elettrospray (ESI-MS) del KRAS4b-FMe è stata utilizzata per misurare il peso molecolare e confermare la presenza delle modifiche al farnesil e al carboxymethyl. La spettrometria di massa nativa, in cui i campioni sono spruzzati con solventi non incustoditi, è stata utilizzata per dimostrare che ANCHE KRAS4b-FMe era legato al suo cofattore del PIL. Infine, è stata utilizzata la spettroscopia per la risonanza del plasonanza superficiale per misurare il legame diretto di KRAS4b-FMe con liposomi immobilizzati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Come indicato nella sezione Risultati rappresentativi, la fase più critica durante la purificazione è la gestione del campione durante il periodo in cui si trova nel sale inferiore. Limitare il tempo di esposizione del campione a meno di 200 mM NaCl contribuirà a ridurre le precipitazioni e ad aumentare la resa del campione. L’interpretazione dei risultati del CEX può essere difficile se il profilo non corrisponde alle aspettative (vedere figura 2). Fino a quando il protocollo non è div…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo il supporto della clonazione e dell’espressione di Carissa Grose, Jen Melhalko e Matt Drew nel Protein Expression Laboratory, Frederick National Laboratory for Cancer Research. Questo progetto è stato finanziato in tutto o in parte con fondi federali del National Cancer Institute, National Institutes of Health, sotto contratto n. HHSN261200800001E. Il contenuto di questa pubblicazione non riflette necessariamente le opinioni o le politiche del Dipartimento della Salute e dei Servizi Umani, né menziona nomi commerciali, prodotti commerciali o organizzazioni implicano l’approvazione da parte del governo degli Stati Uniti
Materials
| 1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural | Eppendorf | 22363204 | |
| 11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials | Thermo Scientific | 30211SS-1232 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | AVANTI POLAR LIPIDS | 850457 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) | AVANTI POLAR LIPIDS | 840034 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 5427R Centrifuge | Eppendorf | ||
| Acetonitrile, HPLC Grade | Fisher Chemical | A998-1 1L | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 09689-250g | |
| Argon gas | Airgas | ARUP | |
| Assay Plate 384 | CORNING | 3544 | |
| Biacore T200 Instrument | GE Healthcare | ||
| Blue Snap-It Seals, T/S | Thermo Scientific | C4011-54B | |
| Branson Ultrasonic Bath | Thermo Fisher | 15-336-1000 | |
| Cation Exchange Chromatography (CEX) column | GE Healthcare Life Sciences | 29018183 | HiPrep SP Sepharose High Performance |
| CHAPS | Sigma | C3023 | |
| Dyna Pro Plate Reader | Wyatt Technologies | ||
| Exactive Plus EMR Mass Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500Ml | Use Reagent Grade or better |
| Gilson vials 7×14 mm Tubes | GE Healthcare | BR-1002-12 | |
| Glass screw thread vials with PTFE foam liners | Scientific Specialities | B69302 | |
| High speed/benchtop centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 05-112-114D | capable of up to 4,000 xg |
| His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease | Addgene | 92414 | Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY |
| Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column | GE Healthcare Life Sciences | 28-9365-51 | HisPrep FF 16/10 |
| In-House Water Supply, Arium Advance | Sartorius Stedim | Resistivity of 18 MΩ0-cm | |
| Lipid extruder set with holder | AVANTI POLAR LIPIDS | 610023 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI-DEWAR | |
| M110-EH microfluidizer | Microfluidics | ||
| MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm | Thermo Scientific | 088645 | |
| MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 Å, 2.1 x 150 mm | Thermo Scientific | 088790 | |
| MagTran software | Thermo Scientific | ||
| Methanol, HPLC Grade | VWR Chemicals | BDH20864.400 | |
| NGC Chromatography System | BioRad | 78880002 | NGC QuestTM 100 Chromatography system |
| Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators | Millipore Sigma | P8849 | |
| Rubber Caps type 3 | GE Healthcare | BR-1005-02 | |
| Series S Sensor Chip L1 | GE Healthcare | 29104993 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | 13-400-519 | Absorbace at 280nm |
| Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL | Millipore Sigma | UFC901008 | PES membrane |
| Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters | Amicon | UFC501024 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima – L80K | capable of 100,000 xg |
| Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System) | Thermo Scientific | ||
| Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | |
| Water, HPLC Grade | Sigma-Aldrich | 270733-1L | May use in-house water source (see below) |
| Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter | GE Healthcare – Whatman | 6994-2504 | |
| Xcalibur QualBrowser | Thermo Scientific | proteomics software |
Referências
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