完全処理された組換えKRAS4b:ファルネシル化およびメチル化タンパク質の分離と特徴付け
Summary
プレニル化は、末梢膜結合タンパク質に対する重要な修飾である。昆虫細胞を操作して、タンパク質とタンパク質と脂質の相互作用の生物物理学的測定を可能にする量でファルネシル化およびカルボキシメチル化KRAS4bを生成することができます
Abstract
タンパク質のプレニル化は、タンパク質を細胞内膜に標的化する重要な修飾です。ヒト癌の22%で変異しているKRAS4bは、C末端に「CAAX」ボックスモチーフの存在によるファルネシル化およびカルボキシメチル化によって処理される。工学的なバキュロウイルス系は、昆虫細胞においてファルネシル化およびカルボキシメチル化KRAS4bを発現するために使用され、以前に説明されている。ここでは、タンパク質の詳細かつ実用的な精製および生化学的特性評価について説明する。具体的には、アフィニティーおよびイオン交換クロマトグラフィーを使用して、タンパク質を均質化して精製した。無傷および天然質量分析法は、KRAS4bの正しい修飾を検証し、ヌクレオチド結合を検証するために使用された。最後に、ファルネシル化およびカルボキシメチル化KRAS4bとリポソームの膜会合を、表面プラズモン共鳴分光法を用いて測定した。
Introduction
翻訳後修飾は、タンパク質の機能活性を定義する上で重要な役割を果たします。リン酸化やグリコシル化などの改変は十分に確立されている。しかし、脂質修飾はあまりよく特徴付けされていない。すべての細胞タンパク質の0.5%が1を前もって打ち出す可能性があると推定されている。前駆処理は、CAAXモチーフ2を含むアクセプタータンパク質への15炭素ファルネシルまたは20炭素ゲラニルゲルニル脂質鎖の転写である。前駆加タンパク質は、早期老化3、アルツハイマー病4、心機能障害5、脈支痛症6、および癌7を含むいくつかのヒト疾患の進行に関与している。小型GTPPas、HRAS、NRAS、およびKRAS1、核ラミニン、およびキネトコレスCENP-EおよびFは、基底状態下でファルネシル化タンパク質である。他の小さなGTPアーゼ、すなわちRhoA、RhoC、Rac1、cdc-42、およびRRASはゲラニエルゲラニ化8であるのに対し、RhoBはファルネシル化またはゲラニエルゲラ化9であり得る。
この小さなGTPe KRAS4bは分子スイッチとして機能し、本質的に細胞内シグナル伝達シグナル伝達を複数のタンパク質間相互作用を介して細胞増殖および増殖を刺激する細胞内シグナル伝達経路に伝達する細胞外増殖因子を伝達する。KRAS4b生化学には、その活動に不可欠な2つの重要な側面があります。まず、非アクティブなGDPと活性GTP結合状態との間のタンパク質サイクルは、エフェクターと積極的に関与する。第二に、C末端ポリリジン領域とファルネシル化およびカルボキシメチル化システインがタンパク質を形質膜に導き、下流エフェクターのリクルートおよび活性化を可能にする。変異型KRAS4bは膵臓癌、大腸癌、肺癌10における発癌性ドライバであり、そのように、治療的介入は巨大な臨床的利益を有するであろう。ファルネシル化およびカルボキシメチル化された本格的に修飾された組換えタンパク質の製造は、リポソームまたは脂質ナノディスク11、12などの膜サロゲートと組み合わせてKRAS4bを用いた生化学的スクリーニングを可能にするであろう。
ファルネシルトランスフェラーゼ(FNT)は、KRAS4bのCAAXモチーフにおけるC末端システインにファルネシルピロリン酸を添加することを触媒する。前駆付後、タンパク質は小胞体(ER)に入れ込み、そこでRas変換酵素(RCE1)が3つのC末端残基を切断します。処理の最終工程は、ER膜蛋白質による新しいC末端ファルネシルシステイン残基のメチル化、イソプレニルシステインカルボキシルメチルトランスフェラーゼ(ICMT)である。大腸菌における組換えKRAS4bの発現は、非修飾タンパク質の産生をもたらす。処理されたKRAS4bを製造する以前の試みは、構造または薬物スクリーニング実験のための不十分な収率のために制限されているか、または天然の全長成熟タンパク質13、14を再現できなかった。ここで提示されるプロトコルは、5mg/Lの細胞培養の収率で高度に精製され、完全に処理されたKRAS4bを生成する、工学的なバキュロウイルスベースの昆虫細胞発現系および精製方法を利用する。
慎重なタンパク質特性評価は、構造生物学や薬物スクリーニング研究に着手する前に、組換えタンパク質の品質を検証するために不可欠です。完全に処理されたKRAS4bの2つの主要なパラメータは、膜置換または脂質との相互作用のための正しいプレニル修飾およびファルネシル化およびカルボキシメチル化C末端(FMe)の利用可能性の検証である。KRAS4b-FMeのエレクトロスプレーイオン化質量分析法(ESI-MS)を用いて分子量を測定し、ファルネシルおよびカルボキシメチル修飾の存在を確認した。サンプルに非変性溶媒を噴霧する天然質量分析法は、KRAS4b-FMeがGDP補因子にも結合していることを実証するために使用された。最後に、表面プラズモン共鳴分光法を用いて、固定化リポソームによるKRAS4b-FMeの直接結合を測定した。
Protocol
Representative Results
Discussion
代表的な結果セクションで述べたように、精製中に最も重要なステップは、より低い塩中のサンプルの取り扱いです。サンプルが200 mM未満のNaClにさらされる時間を制限することは、沈殿を減らし、サンプル収率を高めるのに役立ちます。プロファイルが期待値と一致しない場合、CEX の結果の解釈が困難になる場合があります (図 2参照)。プロトコルがルーチンになるま…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、カリッサ・グロース、ジェン・メルハルコ、マット・ドリューのクローン作成と発現支援を、フレデリック国立がん研究研究所タンパク質発現研究所で認めます。このプロジェクトは、契約番号に基づき、国立がん研究所、国立衛生研究所からの連邦資金の全部または一部に資金を提供しています。HHSN261200800001E.この出版物の内容は、必ずしも保健福祉省の見解や方針を反映したものではなく、商号、商業製品、または組織に関する言及も、米国政府による支持を暗示するものではありません。
Materials
| 1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural | Eppendorf | 22363204 | |
| 11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials | Thermo Scientific | 30211SS-1232 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | AVANTI POLAR LIPIDS | 850457 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) | AVANTI POLAR LIPIDS | 840034 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 5427R Centrifuge | Eppendorf | ||
| Acetonitrile, HPLC Grade | Fisher Chemical | A998-1 1L | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 09689-250g | |
| Argon gas | Airgas | ARUP | |
| Assay Plate 384 | CORNING | 3544 | |
| Biacore T200 Instrument | GE Healthcare | ||
| Blue Snap-It Seals, T/S | Thermo Scientific | C4011-54B | |
| Branson Ultrasonic Bath | Thermo Fisher | 15-336-1000 | |
| Cation Exchange Chromatography (CEX) column | GE Healthcare Life Sciences | 29018183 | HiPrep SP Sepharose High Performance |
| CHAPS | Sigma | C3023 | |
| Dyna Pro Plate Reader | Wyatt Technologies | ||
| Exactive Plus EMR Mass Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500Ml | Use Reagent Grade or better |
| Gilson vials 7×14 mm Tubes | GE Healthcare | BR-1002-12 | |
| Glass screw thread vials with PTFE foam liners | Scientific Specialities | B69302 | |
| High speed/benchtop centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 05-112-114D | capable of up to 4,000 xg |
| His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease | Addgene | 92414 | Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY |
| Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column | GE Healthcare Life Sciences | 28-9365-51 | HisPrep FF 16/10 |
| In-House Water Supply, Arium Advance | Sartorius Stedim | Resistivity of 18 MΩ0-cm | |
| Lipid extruder set with holder | AVANTI POLAR LIPIDS | 610023 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI-DEWAR | |
| M110-EH microfluidizer | Microfluidics | ||
| MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm | Thermo Scientific | 088645 | |
| MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 Å, 2.1 x 150 mm | Thermo Scientific | 088790 | |
| MagTran software | Thermo Scientific | ||
| Methanol, HPLC Grade | VWR Chemicals | BDH20864.400 | |
| NGC Chromatography System | BioRad | 78880002 | NGC QuestTM 100 Chromatography system |
| Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators | Millipore Sigma | P8849 | |
| Rubber Caps type 3 | GE Healthcare | BR-1005-02 | |
| Series S Sensor Chip L1 | GE Healthcare | 29104993 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | 13-400-519 | Absorbace at 280nm |
| Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL | Millipore Sigma | UFC901008 | PES membrane |
| Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters | Amicon | UFC501024 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima – L80K | capable of 100,000 xg |
| Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System) | Thermo Scientific | ||
| Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | |
| Water, HPLC Grade | Sigma-Aldrich | 270733-1L | May use in-house water source (see below) |
| Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter | GE Healthcare – Whatman | 6994-2504 | |
| Xcalibur QualBrowser | Thermo Scientific | proteomics software |
Referências
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