KRAS4b recombinante totalmente procesado: Aislamiento y caracterización de la proteína farnesilada y metilada
Summary
La prenilación es una modificación importante en las proteínas de unión de membrana periférica. Las células de insectos se pueden manipular para producir KRAS4b farnesilado y carboximetilado en cantidades que permiten mediciones biofísicas de interacciones proteína-proteína y proteína-lípidos
Abstract
La prenilación proteica es una modificación clave que es responsable de dirigir las proteínas a las membranas intracelulares. KRAS4b, que está mutado en el 22% de los cánceres humanos, es procesado por farnesylation y carboximetilación debido a la presencia de un motivo de caja ‘CAAX’ en la terminal C. Se utilizó un sistema de baculovirus diseñado para expresar KRAS4b farnesylated y carboxymethylated en células de insectos y se ha descrito anteriormente. Aquí, describimos la purificación detallada y práctica y la caracterización bioquímica de la proteína. Específicamente, la afinidad y la cromatografía de intercambio iónico se utilizaron para purificar la proteína a la homogeneidad. Se utilizó espectrometría de masas intacta y nativa para validar la correcta modificación de KRAS4b y para verificar la unión de nucleótidos. Finalmente, la asociación de membranas de KRAS4b farnesylated y carboximetilado a liposomas se midió utilizando espectroscopía de resonancia plasmórica superficial.
Introduction
Las modificaciones posttranslacionales desempeñan un papel clave en la definición de la actividad funcional de las proteínas. Modificaciones como la fosforilación y la glicosilación están bien establecidas. Sin embargo, las modificaciones de lípidos están menos bien caracterizadas. Se estima que hasta el 0,5% de todas las proteínas celulares pueden ser preniladas1. La prenilación es la transferencia de una farnesil de 15 carbonoos o una cadena de lípidos de geranylgeranilo de 20 carbono a una proteína de recepción que contiene el motivo CAAX2. Las proteínas preniladas se han implicado en la progresión de varias enfermedades humanas incluyendo el envejecimiento prematuro3, Alzheimer4, disfunción cardíaca5, choroideremia6, y cáncer7. Las pequeñas GTPases, HRAS, NRAS y KRAS1,lamininses nucleares y los quinetocoros CENP-E y F son proteínas farnesyladas bajo la condición basal. Otras pequeñas GTPases, a saber, RhoA, RhoC, Rac1, cdc-42, y RRAS son geranylgeranylated8, mientras que RhoB puede ser farnesylated o geranylgeranylated9.
La pequeña GTPase KRAS4b funciona como un interruptor molecular, esencialmente transmitiendo la señalización del factor de crecimiento extracelular a las vías de transducción de señal intracelular que estimulan el crecimiento celular y la proliferación, a través de múltiples interacciones proteína-proteína. Hay dos aspectos clave de la bioquímica KRAS4b que son esenciales para su actividad. En primer lugar, los ciclos proteicos entre un PIB inactivo y un estado vinculado a GTP activo mediante el cual se involucra activamente con los efectores. En segundo lugar, una región de polilisina C-terminal y una cisteína farnesilada y carboximetilada dirigen la proteína a la membrana plasmática, permitiendo el reclutamiento y activación de efectos aguas abajo. Mutant KRAS4b es un conductor oncogénico en el cáncer de páncreas, colorrectal y pulmón10,y como tal, la intervención terapéutica tendría un enorme beneficio clínico. La producción de proteína recombinante auténticamente modificada que esté farnesilada y carboximetilada permitiría el cribado bioquímico utilizando KRAS4b en combinación con sustitutos de membrana como liposomas o nanodiscos lipídicos11,12.
Farnesyl transferase (FNT) cataliza la adición de pirofosfato de farnesil a la cisteína Terminal C en el motivo CAAX en KRAS4b. Después de la prenilación, la proteína se trafica al retículo endoplasmático (ER) donde la enzima conversora Ras (RCE1) corta los tres residuos C-terminal. El último paso en el procesamiento es la metilación del nuevo residuo de farnesilcisteína C-terminal por la proteína de membrana ER, isoprenylcysteine carboxyl methyltransferase (ICMT). La expresión de KRAS4b recombinante en E. coli da como resultado la producción de una proteína no modificada. Los intentos anteriores de producir KRAS4b procesado han sido limitados debido a rendimientos insuficientes para experimentos estructurales o de detección de drogas o no han podido recapitular la proteína madura nativa de longitud completa13,14. El protocolo presentado aquí utiliza un sistema de expresión de células de insectos basado en baculovirus de ingeniería y un método de purificación que genera KRAS4b altamente purificado y completamente procesado a rendimientos de 5 mg/L de cultivo celular.
La caracterización cuidadosa de las proteínas es esencial para validar la calidad de las proteínas recombinantes antes de embarcarse en la biología estructural o en estudios de detección de fármacos. Dos parámetros clave de KRAS4b completamente procesado son la validación de la correcta modificación prenilo y la disponibilidad de la termino C farnesylated y carboxymethylated C-terminus (FMe) para la interacción con sustitutos de membrana o lípidos. La espectrometría de masas de ionización por electrospray (ESI-MS) del KRAS4b-FMe se utilizó para medir el peso molecular y confirmar la presencia de las modificaciones de farnesilo y carboximetil. La espectrometría de masas nativa, donde las muestras se pulverizan con disolventes no desnaturalizantes, se utilizó para demostrar que KRAS4b-FMe también estaba vinculado a su cofactor del PIB. Finalmente, se utilizó espectroscopia de resonancia de plásmo superficial para medir la unión directa de KRAS4b-FMe con liposomas inmovilizados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como se indica en la sección Resultados representativos, el paso más crítico durante la purificación es el manejo de la muestra durante el tiempo que se encuentra en sal más baja. Limitar el tiempo que la muestra está expuesta a menos de 200 mM NaCl ayudará a reducir la precipitación y aumentar el rendimiento de la muestra. La interpretación de los resultados del CEX puede ser difícil si el perfil no coincide con las expectativas (véase la figura 2). Hasta que el protocolo se haya…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos la clonación y el apoyo a la expresión de Carissa Grose, Jen Melhalko y Matt Drew en el Laboratorio de Expresión de Proteínas, Frederick National Laboratory for Cancer Research. Este proyecto ha sido financiado total o parcialmente con fondos federales del Instituto Nacional del Cáncer, Institutos Nacionales de Salud, bajo el Contrato No. HHSN261200800001E. El contenido de esta publicación no refleja necesariamente las opiniones o políticas del Departamento de Salud y Servicios Humanos, ni la mención de nombres comerciales, productos comerciales u organizaciones implica la aprobación por parte del Gobierno de los Estados Unidos
Materials
| 1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural | Eppendorf | 22363204 | |
| 11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials | Thermo Scientific | 30211SS-1232 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | AVANTI POLAR LIPIDS | 850457 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) | AVANTI POLAR LIPIDS | 840034 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 5427R Centrifuge | Eppendorf | ||
| Acetonitrile, HPLC Grade | Fisher Chemical | A998-1 1L | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 09689-250g | |
| Argon gas | Airgas | ARUP | |
| Assay Plate 384 | CORNING | 3544 | |
| Biacore T200 Instrument | GE Healthcare | ||
| Blue Snap-It Seals, T/S | Thermo Scientific | C4011-54B | |
| Branson Ultrasonic Bath | Thermo Fisher | 15-336-1000 | |
| Cation Exchange Chromatography (CEX) column | GE Healthcare Life Sciences | 29018183 | HiPrep SP Sepharose High Performance |
| CHAPS | Sigma | C3023 | |
| Dyna Pro Plate Reader | Wyatt Technologies | ||
| Exactive Plus EMR Mass Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500Ml | Use Reagent Grade or better |
| Gilson vials 7×14 mm Tubes | GE Healthcare | BR-1002-12 | |
| Glass screw thread vials with PTFE foam liners | Scientific Specialities | B69302 | |
| High speed/benchtop centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 05-112-114D | capable of up to 4,000 xg |
| His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease | Addgene | 92414 | Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY |
| Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column | GE Healthcare Life Sciences | 28-9365-51 | HisPrep FF 16/10 |
| In-House Water Supply, Arium Advance | Sartorius Stedim | Resistivity of 18 MΩ0-cm | |
| Lipid extruder set with holder | AVANTI POLAR LIPIDS | 610023 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI-DEWAR | |
| M110-EH microfluidizer | Microfluidics | ||
| MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm | Thermo Scientific | 088645 | |
| MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 Å, 2.1 x 150 mm | Thermo Scientific | 088790 | |
| MagTran software | Thermo Scientific | ||
| Methanol, HPLC Grade | VWR Chemicals | BDH20864.400 | |
| NGC Chromatography System | BioRad | 78880002 | NGC QuestTM 100 Chromatography system |
| Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators | Millipore Sigma | P8849 | |
| Rubber Caps type 3 | GE Healthcare | BR-1005-02 | |
| Series S Sensor Chip L1 | GE Healthcare | 29104993 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | 13-400-519 | Absorbace at 280nm |
| Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL | Millipore Sigma | UFC901008 | PES membrane |
| Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters | Amicon | UFC501024 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima – L80K | capable of 100,000 xg |
| Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System) | Thermo Scientific | ||
| Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | |
| Water, HPLC Grade | Sigma-Aldrich | 270733-1L | May use in-house water source (see below) |
| Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter | GE Healthcare – Whatman | 6994-2504 | |
| Xcalibur QualBrowser | Thermo Scientific | proteomics software |
Referências
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