Volledig verwerkte recombinant KRAS4b: isoleren en karakteriseren van het Farnesylated en gemethyleerd eiwit
Summary
Prenylatie is een belangrijke modificatie op perifere membraan bindende eiwitten. Insecten cellen kunnen worden gemanipuleerd om gefarnesylen carboxymethylated KRAS4b te produceren in hoeveelheden die biofysische metingen van eiwit-eiwit-en proteïne-lipide-interacties mogelijk maken
Abstract
Eiwit prenylatie is een belangrijke modificatie die verantwoordelijk is voor het richten van eiwitten op intracellulaire membranen. KRAS4b, dat wordt gemuleerd in 22% van de menselijke kankers, wordt verwerkt door farnesylatie en carboxymethylatie als gevolg van de aanwezigheid van een ‘ CAAX ‘ vak motief bij het C-Terminus. Een Engineered Baculovirus systeem werd gebruikt om farnesylated en carboxymethylated KRAS4b in insecten cellen uit te drukken en is eerder beschreven. Hier beschrijven we de gedetailleerde, praktische zuivering en Biochemische karakterisering van het eiwit. Met name werden affiniteit en ionenwisselingschromatografie gebruikt om het eiwit te zuiveren tot homogeniteit. Intact en inheemse massaspectrometrie werd gebruikt voor het valideren van de juiste modificatie van KRAS4b en om te controleren of nucleotide binding. Tot slot werd de membraan vereniging van farnesylated en carboxymethylated KRAS4b aan liposomen gemeten met behulp van oppervlakte Plasmon resonantie spectroscopie.
Introduction
Posttranslationele modificaties spelen een belangrijke rol bij het bepalen van de functionele activiteit van eiwitten. Wijzigingen zoals fosforylering en glycosylatie zijn goed vastgesteld. Lipide-modificaties zijn echter minder goed gekarakteriseerd. Geschat wordt dat maar liefst 0,5% van alle cellulaire eiwitten kunnen worden prenylated1. Prenylation is de overdracht van een 15-Carbon het of een 20-Carbon geranylgeranyl lipide keten aan een acceptor eiwit met de caax Motif2. Prenylated eiwitten zijn betrokken bij de progressie van verschillende ziekten van de mens, met inbegrip van vroegtijdige veroudering3, Alzheimer4, cardiale disfunctie5, choroideremia6, en kanker7. De kleine gtpases, hri’s, nri’s, en kras1, nucleaire laminaten, en de kinetochoren cenp-E en F zijn farnesylated eiwitten onder de basale aandoening. Andere kleine GTPases, namelijk RhoA, RhoC, Rac1, CDC-42 en RRAS zijn geranylgeranylated8, terwijl rhob farnesylated of geranylgeranylated9kan zijn.
De kleine GTPase KRAS4b fungeert als een moleculaire switch, in wezen overdracht van extracellulaire groeifactor signalering naar intracellulaire signaaltransductie trajecten die celgroei en proliferatie stimuleren, via meerdere eiwit-eiwit interacties. Er zijn twee belangrijke aspecten van KRAS4b biochemie die essentieel zijn voor haar activiteit. Ten eerste, de eiwit cycli tussen een inactief BBP en een actieve GTP gebonden toestand waarbij het actief met Effectors bezig is. Tweede, een C-terminale poly-lysine regio en een farnesylated en carboxymethylated cysteïne direct het eiwit naar het plasma membraan, waardoor werving en activering van stroomafwaartse Effectors. Mutant KRAS4b is een oncogene driver in pancreatic, colorectale en longkanker10, en als zodanig, therapeutische interventie zou een groot klinisch voordeel hebben. Productie van authentiek gemodificeerd recombinant eiwit dat is farnesylated en carboxymethylated zou biochemische screening mogelijk maken met behulp van KRAS4b in combinatie met membraan surrogaten zoals liposomen of lipide nano schijven11,12.
Het Transferase (fnt) katalyseert de toevoeging van het pyrofosfaat aan de C-terminale cysteïne in het caax motief in KRAS4b. Na prenylatie wordt het eiwit verhandeld aan het endoplasmisch reticulum (er) waar het RAS converting enzym (RCE1) de drie C-terminale residuen Slaid. De laatste stap in de verwerking is methylering van het nieuwe C-terminale farnesylcysteïne residu door het ER membraan proteïne, isoprenylcysteïne carboxylgroep methyltransferase (ICMT). Expressie van recombinant KRAS4b in E. coli resulteert in de productie van een ongemodificeerd eiwit. Eerdere pogingen om verwerkte KRAS4b te produceren zijn beperkt als gevolg van onvoldoende opbrengsten voor structurele of drug screening experimenten of hebben nagelaten om de inheemse full-length volwassen eiwit13,14te recapituleren. Het protocol hier gepresenteerd maakt gebruik van een Engineered Baculovirus gebaseerde insect Cell expressie systeem en zuiveringsmethode die zeer gezuiverde, volledig verwerkte KRAS4b genereert bij rendementen van 5 mg/L celcultuur.
Zorgvuldige eiwit karakterisering is essentieel voor het valideren van de kwaliteit van recombinant eiwitten voorafgaand aan het beginnen met structurele biologie of drug screening studies. Twee belangrijke parameters van volledig verwerkte KRAS4b zijn validatie van de juiste prenyl-modificatie en de beschikbaarheid van de farnesylated en carboxymethylated C-Terminus (FMe) voor interactie met membraan vervangers of lipiden. Elektro spray ionisatie massaspectrometrie (ESI-MS) van de KRAS4b-FME werd gebruikt om het molecuulgewicht te meten en de aanwezigheid van de het en Carboxymethyl modificaties te bevestigen. Inheemse massaspectrometrie, waarbij monsters worden besproeid met niet-denaturerende oplosmiddelen, werd gebruikt om aan te tonen dat KRAS4b-FMe ook gebonden was aan zijn BBP cofactor. Ten slotte werd oppervlak Plasmon resonantie spectroscopie gebruikt om de directe binding van KRAS4b-FMe met geïmmobiliseerde liposomen te meten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zoals opgemerkt in de representatieve resultaten sectie, de meest kritieke stap tijdens de zuivering is de behandeling van het monster gedurende de tijd dat het in lager zout. Het beperken van de tijd dat het monster wordt blootgesteld aan minder dan 200 mM NaCl zal helpen verminderen neerslag en verhoging van de monster opbrengst. Interpretatie van de resultaten van de CEX kan moeilijk zijn als het profiel niet overeenkomt met de verwachtingen (Zie Figuur 2). Totdat het protocol routine is …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We erkennen het klonen en expressie steun van Carissa Grose, Jen Melhalko, en Matt Drew in het proteïne Expression laboratorium, Frederick National Laboratory voor kankeronderzoek. Dit project is geheel of gedeeltelijk gefinancierd met federale fondsen van het nationaal kanker instituut, National Institutes of Health, onder contract nr. HHSN261200800001E. De inhoud van deze publicatie weerspiegelt niet noodzakelijkerwijs de standpunten of het beleid van het Department of Health and Human Services, noch vermeldt handelsnamen, commerciële producten of organisaties goedkeuring door de Amerikaanse overheid
Materials
| 1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural | Eppendorf | 22363204 | |
| 11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials | Thermo Scientific | 30211SS-1232 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | AVANTI POLAR LIPIDS | 850457 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) | AVANTI POLAR LIPIDS | 840034 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 5427R Centrifuge | Eppendorf | ||
| Acetonitrile, HPLC Grade | Fisher Chemical | A998-1 1L | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 09689-250g | |
| Argon gas | Airgas | ARUP | |
| Assay Plate 384 | CORNING | 3544 | |
| Biacore T200 Instrument | GE Healthcare | ||
| Blue Snap-It Seals, T/S | Thermo Scientific | C4011-54B | |
| Branson Ultrasonic Bath | Thermo Fisher | 15-336-1000 | |
| Cation Exchange Chromatography (CEX) column | GE Healthcare Life Sciences | 29018183 | HiPrep SP Sepharose High Performance |
| CHAPS | Sigma | C3023 | |
| Dyna Pro Plate Reader | Wyatt Technologies | ||
| Exactive Plus EMR Mass Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500Ml | Use Reagent Grade or better |
| Gilson vials 7×14 mm Tubes | GE Healthcare | BR-1002-12 | |
| Glass screw thread vials with PTFE foam liners | Scientific Specialities | B69302 | |
| High speed/benchtop centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 05-112-114D | capable of up to 4,000 xg |
| His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease | Addgene | 92414 | Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY |
| Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column | GE Healthcare Life Sciences | 28-9365-51 | HisPrep FF 16/10 |
| In-House Water Supply, Arium Advance | Sartorius Stedim | Resistivity of 18 MΩ0-cm | |
| Lipid extruder set with holder | AVANTI POLAR LIPIDS | 610023 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI-DEWAR | |
| M110-EH microfluidizer | Microfluidics | ||
| MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm | Thermo Scientific | 088645 | |
| MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 Å, 2.1 x 150 mm | Thermo Scientific | 088790 | |
| MagTran software | Thermo Scientific | ||
| Methanol, HPLC Grade | VWR Chemicals | BDH20864.400 | |
| NGC Chromatography System | BioRad | 78880002 | NGC QuestTM 100 Chromatography system |
| Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators | Millipore Sigma | P8849 | |
| Rubber Caps type 3 | GE Healthcare | BR-1005-02 | |
| Series S Sensor Chip L1 | GE Healthcare | 29104993 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | 13-400-519 | Absorbace at 280nm |
| Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL | Millipore Sigma | UFC901008 | PES membrane |
| Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters | Amicon | UFC501024 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima – L80K | capable of 100,000 xg |
| Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System) | Thermo Scientific | ||
| Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | |
| Water, HPLC Grade | Sigma-Aldrich | 270733-1L | May use in-house water source (see below) |
| Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter | GE Healthcare – Whatman | 6994-2504 | |
| Xcalibur QualBrowser | Thermo Scientific | proteomics software |
Referências
- Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
- Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).
- Hottman, D. A., Li, L. Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer’s disease. Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).
- Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. HDL and cognition in neurodegenerative disorders. Neurobiology of Disease. 72, 22-36 (2014).
- Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms. Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).
- Kohnke, M., et al. Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease. PLoS One. 8 (12), 81758 (2013).
- Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. Targeting protein prenylation for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).
- Kho, Y., et al. A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).
- Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).
- Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. Dragging ras back in the ring. Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).
- Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics. Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).
- Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles. Journal of Visualized Experiments. (66), e3910 (2012).
- Dementiev, A. K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation. Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).
- Lowe, P. N., et al. Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems. Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).
- Gillette, W., et al. Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System. Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).
- Agamasu, C., et al. KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner. Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).
- Talsania, K., et al. Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies. Genes. 10 (2), 79 (2019).
- Spencer-Smith, R., et al. Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site. Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).
- Lowe, P. N., et al. Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system. Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).
- Dharmaiaha, S., et al. Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDEδ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).
- Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore. Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).
- Fisher, R. J., et al. Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).
- Lakshman, B., et al. Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).
