Analisi della metilazione LINE-1 nelle cellule staminali mesenchietratta con Vescicoli Extracellulari Derivati dall'Osteosarcoma
Summary
Di seguito è descritto l’uso di un metodo di amplificazione della sonda specifico per la metilazione per analizzare i livelli di metilazione degli elementi LINE-1 nelle cellule staminali mesenchymiche trattate con vescicle extracellulari derivate dall’osteosarcoma. È inoltre dimostrata l’ultracentrifuga, una procedura popolare per separare le vesciche extracellulari dal siero bovino fetale.
Abstract
L’amplificazione della sonda specifica per la metilazione (MSPA) è una tecnica semplice e robusta che può essere utilizzata per rilevare differenze relative nei livelli di metilazione dei campioni di DNA. È pieno di risorse, richiede piccole quantità di DNA e richiede circa 4-5 h di lavoro pratico. Nella tecnica presentata, i campioni di DNA vengono prima denaturati e quindi ibridati su sonde che prendono di mira il DNA in siti metilati o di riferimento come controllo. Il DNA ibridato è separato in reazioni parallele, una sottoposta solo a legatura e l’altra sottoposta a legatura seguita dalla digestione mediata da HhaI in sequenze GCGC non metilate. I frammenti di DNA risultanti sono amplificati dalla PCR e separati dall’elettroforesi capillare. I siti GCGC metilati non vengono digeriti da HhaI e producono segnali di picco, mentre i siti GCGC non metilati vengono digeriti e non vengono generati segnali di picco. Confrontando i picchi normalizzati dal controllo delle versioni digerite e non digerite di ogni campione si fornisce il rapporto di dosaggio della metilazione di un campione di DNA. Qui, MSPA viene utilizzato per rilevare gli effetti delle vesciche extracellulari derivate dall’osteosarcoma (EV) sullo stato di metilazione dell’elemento nucleare a lungo intervallato-1 (LINE-1) nelle cellule staminali mesenmalmalmal. I LINE-1 sono elementi di DNA ripetitivi che in genere subiscono l’ipometilazione nel cancro e, in questa capacità, possono fungere da biomarcatore. L’ultracentrifugato è anche usato come metodo conveniente per separare le vesciche extracellulari dai fluidi biologici (cioè, durante la preparazione del siero bovino fetale impoverito di EV [FBS] e l’isolamento dei vescitabi dai media condizionati dall’osteosarcoma [centrifugazione differenziale]). Per l’analisi della metilazione, le sonde LINE-1 personalizzate sono progettate per indirizzare tre siti di metilazione nella sequenza promotrice LINE-1 e sette siti di controllo. Questo protocollo dimostra l’uso di MSPA per l’analisi della metilazione LINE-1 e descrive la preparazione di FBS impoverito da EV per ultracentrifugazione.
Introduction
La metilazione del DNA è una grande modifica epigenetica che si verifica nelle cellule umane. La metilazione del DNA si riferisce al collegamento dei gruppi metilici ai residui di citosina nei dinucleotidi CpG. Tali dinucleotidi si trovano di solito negli ammassi (isole CpG) nella regione 5′ dei geni1. Nelle cellule normali, la maggior parte di questi dinucleotidi esiste in uno stato non metilato, che consente la trascrizione del DNA. Per inciso, molti tumori sono associati con le isole CpG ipermetillate e il silenziamento trascrittomico2, soprattutto nei geni soppressori tumorali, che a loro volta contribuiscono a vari segni distintivi del cancro3.
D’altra parte, lunghi elementi nucleari interspersati-1 (LINE-1 o L1) sono elementi di DNA ripetitivi e trasponibili che normalmente hanno alti livelli di metilazione nelle isole CpG. La metilazione di LINE-1 previene la traslocazione e aiuta a mantenere l’integrità del genoma. In diversi tipi di cancro, LINE-1 è ipometilato, con conseguente attivazione e successiva instabilità cromosomica retrotrassima mediata4. LINE-1 rappresenta quasi il 17% del genoma umano5e il suo stato di metilazione può fungere da indicatore dei livelli di metilazione genomica globale6. Si ritiene che l’ipometilazione line-1 globale preceda la transizione delle cellule a un fenotipo tumorale7; quindi, promette come potenziale marcatore per l’insorgenza precoce del cancro.
Attualmente, ci sono diversi metodi per l’analisi della metilazione, tra cui la pigzoncazione, la metilazione specifica PCR, microarray e l’immunoprecipitazioni della cromatina1. L’uso del sequenziamento di nuova generazione ha anche permesso di incorporare approcci a livello di genoma per la rilevazione della metilazione del DNA. Molti di questi metodi si basano sul DNA trattato con bisulfite, in cui le citosine non metilate vengono convertite in uracile e le citosine metilate rimangono invariate. Tuttavia, lavorare con il DNA trattato con bisulfite ha diverse insidie, come conversioni incomplete di citosine non metilate in uracili, amplificazione di biasima delle sequenze e errori di sequenza8.
Nell’amplificazione della sonda specifica per la metilazione (MSPA), le sonde composte da due oligonucleotidi prendono di mira sequenze di DNA contenenti un sito di restrizione (GCGC) per l’enzima di restrizione sensibile alla metilazione HhaI9. Dopo che le sonde si ibridano al DNA, ogni campione viene diviso in due set. Le sonde nel primo set vengono sottoposte a legatura, mentre le sonde nel secondo set vengono sottoposte a legatura seguita da una digestione mediata di HhaI in siti CGCG non metilati. Entrambi i set di campioni vengono poi amplificati dalla PCR e i prodotti sono separati da elettroforesi capillare. Le sonde nei siti non metilati vengono digerite da HhaI e non vengono amplificate durante la PCR, con conseguente assenza di segnali di picco. Al contrario, le sonde nei siti metilati sono protette dalla digestione e sono quindi amplificate durante la PCR, generando successivamente segnali di picco10.
MSPA presenta diversi vantaggi rispetto ai metodi alternativi. In primo luogo, richiede una bassa quantità di DNA (50-100 ng) ed è adatto per l’analisi del DNA da campioni incorporati di paraffina fissati in formalina10. Non richiede DNA trattato con bisulfiti; infatti, non è adatto per il DNA che viene modificato in questo modo. Molti campioni possono essere analizzati contemporaneamente e le sonde MSPA possono essere progettate in modo che si rivolgono a più geni o sequenze contemporaneamente. Inoltre, le sonde sono specifiche e sensibili per il DNA metilato come il sito di restrizione HhaI corrisponde a una sequenza che è tipica delle isole CpG10.
Questo studio ha studiato gli effetti delle vesciche extracellulari derivate dall’osteosarcoma (OS) (EV) sulla metilazione LINE-1 nelle cellule staminali mesenchimale derivate da tessuto adiposo (AT-MSC; Figura 1). Gli EV sono su nanoscala, vesciche legate a membrana secrete dalla maggior parte dei tipi di cellule. Trasportano proteine, lipidi, mRNA, microRNA e molecole aggiuntive dalle cellule dei genitori11,12. Gli EV mediano la comunicazione intercellulare e svolgono ruoli importanti in diverse condizioni patofisiologiche13,14. Uno studio recente ha dimostrato che gli EV derivati dal cancro possono trasferire line-1 attivi alle cellule ricevente15. È stato riferito in precedenza che i veicoli elettrici della linea cellulare HOS-143B possono alterare lo stato di metilazione di LINE-1 nelle MSC, oltre ad altri effetti genetici16.
Quando si coltivano cellule per l’isolamento EV, è importante utilizzare il siero bovino fetale impoverito di EV [FBS] nel mezzo di crescita, poiché gli EV derivati da FBS possono interferire con i veicoli elettrici provenienti da altre fonti e ostacolare i risultati17,18. L’ultracentrifugazione è uno dei metodi più comuni per esaurire i VE da FBS. Si tratta di una procedura relativamente semplice ed economica rispetto ad alternative come l’ultrafiltrazione e l’esaurimento commerciale di FBS19. Qui, il protocollo dimostra anche come preparare FBS impoverito da EV per ultracentrifugazione.
In questo articolo viene presentata un protocollo dettagliato per le tecniche di cui sopra, dall’isolamento dei veicoli elettrici da una linea cellulare del sistema operativo all’analisi della metilazione di LINE-1 negli MSC trattati con OS-EV (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo studio illustra come mspA può essere utilizzato per rilevare e quantificare lo stato di metilazione di uno specifico elemento genetico. LINE-1 è stato il focus qui, ma le sonde possono essere progettate per indirizzare una serie di geni e sequenze. Inoltre, c’è un elenco crescente di miscele di sonde disponibili per diverse applicazioni. MSPA è una tecnica semplice e robusta per l’analisi della metilazione del DNA che non richiede la conversione bisulfita10. La procedura completa dalla …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dal finanziamento del progetto dell’Università di Helsinki (WBS490302, WBS73714112) Finanziamento dello Stato ospedaliero universitario di Helsinki per la ricerca sanitaria a livello universitario (Y1014SUL05, TYH2016130), Finnish-Norwegian Medical Foundation, e la Selma e Maja-Lisa Selander Fund (Fondazione Minerva). Ringraziamo Walter Pavicic per aver fornito il protocollo MSPA modificato e per il relativo supporto tecnico. Siamo grati a Teemu Masalin (Università di Helsinki) per averci aiutato con la produzione video.
Materials
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | for NTA |
| 24-well plate | Corning | 3524 | MSC cell culture |
| 3730xl DNA Analyzer | Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific | 3730XL | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | Beckman | ||
| BlueStar Prestained Protein Marker | Nippon Genetics | MWP03 | WB: protein marker |
| Calnexin (clone C5C9) | Cell Signaling Technology | 2679 | WB, dilution 1:800 |
| CD63 (clone H5C6) | BD Biosciences | 556019 | WB, dilution 1:1000 |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | 5703000010 | For conditioned media and cells |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810000010 | For spinning down 96-well plate |
| Centrifuge tube (polyallomer, 14×95 mm) | Beckman | 331374 | Ultracentrifugation |
| DMEM/F-12 + GlutaMAX medium | Gibco, Life Technologies | 31331-028 | For AT-MSC culture |
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies | 10270-106 | |
| GeneScan 500 LIZ size standard | Applied Biosystems, Life Technologies | 4322682 | for capillary electrophoresis |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2-10RXN | for MSPA negative control |
| Hi-Di formamide | Applied Biosystems, Life Technologies | 4311320 | for capillary electrophoresis |
| HOS-143B cell line | ATCC | CRL-8303 | |
| Hsp70 (clone 5G10) | BD Biosciences | 554243 | WB, dilution 1:1000 |
| IRDye 800CW Goat anti-mouse | Li-Cor | 926-32210 | WB: secondary |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit | Li-Cor | 926-32211 | WB: secondary |
| LINE-1 probe-mix primers | IDT | Sequences in Table 1 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode | Applied Biosystems, Life Technologies | 4306737 | also requires sealing film |
| Micro BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | measure protein concentration |
| MiniProtean TGX 10% gels | Bio-Rad | 456-1034 | WB: gel electrophoresis |
| NanoSight LM14C | Malvern Instruments | for NTA | |
| Nitrocellulose membrane 0.2 µm | Bio-Rad | 1620112 | WB: protein transfer |
| NucleoSpin Tissue XS | Macherey-Nagel | 740901.50 | for DNA extraction |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | WB: blocking, antibodies |
| PBS, 1X | Corning | 21-040-CVR | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Life Technologies | DE17-602E | Antibiotics for culture media |
| Protein LoBind tube, 0.5 mL | Eppendorf | 22431064 | For storing Evs |
| REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit | Li-Cor | 926-11015 | WB: total protein staining |
| RKO cell line | ATCC | CRL-2577 | for MSPA positive control |
| RPMI medium 1640 + GlutaMAX | Gibco, Life Technologies | 61870-010 | For HOS-143B cell culture |
| SALSA MLPA HhaI enzyme | MRC-Holland | SMR50 | |
| SALSA MLPA reagent kit | MRC-Holland | EK1-FAM | |
| SALSA MLPA P300 probe-mix | MRC-Holland | P300-100R | |
| Swinging rotor SW-28 | Beckman Coulter | 342207 | Ultracentrifugation |
| Syringe filter, 0.22 µm | Jet Biofil | FPE-204-030 | sterile filtering FBS |
| Tecnai 12 | FEI Company | equipped with Gatan Orius SC 1000B CCD-camera (Gatan Inc., USA); for TEM |
|
| TBS, 1X tablets | Medicago | 09-7500-100 | WB: buffer |
| Trans-Blot Turbo | Bio-Rad | WB: transfer | |
| Thermal cycler | ThermoFisher Scientific | TCA0096 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | for trypsinization of cells |
| TSG101 (clone 4A10) | Sigma | SAB2702167 | WB, dilution 1:500 |
Referências
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