Análise de metilação LINE-1 em células-tronco mesenquimicas tratadas com vesículas extracelulares derivadas de Osteosarcoma

Snehadri Sinha; Bettina Mannerström; Riitta Seppänen-Kaijansinkko; Sippy Kaur

doi:10.3791/60705

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Artigo de método

Análise de metilação LINE-1 em células-tronco mesenquimicas tratadas com vesículas extracelulares derivadas de Osteosarcoma

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DOI:

10.3791/60705

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1 de fevereiro de 2020

Snehadri Sinha^*¹^,² , Bettina Mannerström^*¹^,² , Riitta Seppänen-Kaijansinkko¹^,² , Sippy Kaur¹^,²

¹Department of Oral and Maxillofacial Diseases, University of Helsinki, ²Helsinki University Hospital

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Descrito aqui está o uso de um método específico de amplificação de sondas para analisar os níveis de metilação de elementos LINE-1 em células-tronco mesenquimicas tratadas com vesículas extracelulares derivadas de osteossarcoma. A ultracentrífugação, procedimento popular para separar vesículas extracelulares do soro bovino fetal, também é demonstrado.

Resumo

A amplificação de sondas específicas de metilação (MSPA) é uma técnica simples e robusta que pode ser usada para detectar diferenças relativas nos níveis de metilação de amostras de DNA. É engenhoso, requer pequenas quantidades de DNA, e leva cerca de 4-5 h de trabalho prático. Na técnica apresentada, as amostras de DNA são primeiro desnaturadas e hibridizadas para sondas que visam DNA em locais metilados ou de referência como controle. O DNA hibrilado é separado em reações paralelas, uma passando apenas por ligadura e outra passando por ligadura seguida de digestão mediada por HhaI em sequências de GCGC não metiladas. Os fragmentos de DNA resultantes são amplificados pelo PCR e separados por eletroforese capilar. Os locais de GCGC metilados não são digeridos pelo HhaI e produzem sinais de pico, enquanto os locais de GCGC não metilados são digeridos e nenhum sinal de pico é gerado. Comparar os picos normalizados de controle de versões digeridas e não digeridas de cada amostra fornece a razão de dosagem de metilação de uma amostra de DNA. Aqui, o MSPA é usado para detectar os efeitos das vesículas extracelulares derivadas de osteossarcoma (EVs) sobre o estado de metilação do elemento nuclear longo-1 (LINE-1) em células-tronco mesenquimicas. Line-1 s são elementos repetitivos de DNA que normalmente sofrem hipometiação no câncer e, nesta capacidade, podem servir como um biomarcador. A ultracentrifugação também é usada como um método econômico para separar vesículas extracelulares de fluidos biológicos (ou seja, ao preparar o soro bovino fetal empobrecido por EV [FBS] e isolando OsVs da mídia condicionada pela osteossarcoma [centrífuga diferencial]). Para análise de metilação, as sondas LINE-1 personalizadas são projetadas para atingir três locais de metilação na sequência de promotores line-1 e sete locais de controle. Este protocolo demonstra o uso do MSPA para análise de metilação LINE-1 e descreve a preparação do FBS empobrecido por EV por ultracentrifugação.

Introdução

A metilação de DNA é uma grande modificação epigenética que ocorre em células humanas. A metilação de DNA refere-se à ligação de grupos de metila a resíduos de citosina em dinucleotídeos cpg. Tais dinucleotídeos são geralmente encontrados em aglomerados (ilhas CpG) na região de 5' genes¹. Em células normais, a maioria desses dinucleotídeos existem em um estado não metilado, o que permite a transcrição do DNA. Aliás, muitos cânceres estão associados a ilhas cpg hipermetiladas e silenciamento transcrita², especialmente em genes supressores tumorais, que por sua vez contribuem para várias marcas do câncer^3....