यहां वर्णित एक मिथाइलेशन-विशिष्ट जांच प्रवर्धन विधि का उपयोग किया गया है ताकि ऑस्टियोसारकोमा-व्युत्पन्न एक्स्सेलुलर वेसिकल्स के साथ इलाज किए जाने वाले मेसेंचिमल स्टेम कोशिकाओं में लाइन-1 तत्वों के मिथाइलेशन स्तर का विश्लेषण किया जा सके। अल्ट्रासेंट्रोइफेशन, भ्रूण गोजातीय सीरम से बाह्य वेसिकल्स को अलग करने के लिए एक लोकप्रिय प्रक्रिया भी प्रदर्शित की जाती है।
मिथाइलेशन-विशिष्ट जांच प्रवर्धन (एमएसपीए) एक सरल और मजबूत तकनीक है जिसका उपयोग डीएनए नमूनों के मिथाइलेशन स्तर में सापेक्ष अंतर का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। यह साधन संपन्न है, डीएनए की छोटी मात्रा की आवश्यकता है, और हाथ पर काम के 4-5 घंटे के आसपास लेता है । प्रस्तुत तकनीक में, डीएनए नमूनों को पहले विकृत किया जाता है, फिर जांच के लिए संक्षेप किया जाता है जो नियंत्रण के रूप में या तो मेथाइलेटेड या संदर्भ स्थलों पर डीएनए को लक्षित करते हैं। संक्षेप में डीएनए समानांतर प्रतिक्रियाओं में अलग हो जाता है, एक केवल लिगेशन के दौर से गुजर रहा है और दूसरा लिगेशन के दौर से गुजर रहा है जिसके बाद अमेथिलेटेड जीसीजीसी दृश्यों में एचएआई-मध्यस्थता पाचन है। परिणामी डीएनए टुकड़ों को पीसीआर द्वारा परिलक्षित किया जाता है और केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अलग किया जाता है। मेथिलेटेड जीसीजीसी साइटें एचएचएआई द्वारा पचा नहीं पाती हैं और पीक सिग्नल का उत्पादन करती हैं, जबकि अनमेथिलेटेड जीसीजीसी साइटें पचा जाती हैं और कोई पीक सिग्नल उत्पन्न नहीं होते हैं। प्रत्येक नमूने के पचाने और पचाने वाले संस्करणों के नियंत्रण-सामान्यीकृत चोटियों की तुलना डीएनए नमूने का मिथाइलेशन खुराक अनुपात प्रदान करता है। यहां, एमएसपीए का उपयोग मेसेंचिमल स्टेम सेल में लंबे अंतराल वाले परमाणु तत्व-1 (लाइन-1) के मिथाइलेशन स्थिति पर ऑस्टियोसारकोमा-व्युत्पन्न एक्स्सेल्युलर वेसिकल्स (ईवीएस) के प्रभावों का पता लगाने के लिए किया जाता है। लाइन-1s दोहराव वाले डीएनए तत्व हैं जो आमतौर पर कैंसर में हाइपोमेथिलेशन से गुजरते हैं और इस क्षमता में, बायोमार्कर के रूप में काम कर सकते हैं। अल्ट्रासेन्स्ट्रियूगेशन का उपयोग जैविक तरल पदार्थों (यानी ईवी-समाप्त भ्रूण गोजातीय सीरम [एफबीएस] से एक्सपेरिमेंटल वेसिकल्स को अलग करने और ऑस्टियोसारकोमा वातानुकूलित मीडिया [अंतर केंद्रीकरण] से ईवीएस को अलग करने के लिए एक लागत प्रभावी विधि के रूप में भी किया जाता है। मिथाइलेशन विश्लेषण के लिए, कस्टम लाइन-1 जांच लाइन-1 प्रमोटर अनुक्रम और सात नियंत्रण साइटों में तीन मिथाइलेशन साइटों को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन की गई है। यह प्रोटोकॉल लाइन-1 मिथाइलेशन विश्लेषण के लिए एमएसपीए के उपयोग को दर्शाता है और अल्ट्रासेंट्रोइफिगेनेशन द्वारा ईवी-समाप्त एफबीएस की तैयारी का वर्णन करता है।
डीएनए मिथाइलेशन मानव कोशिकाओं में होने वाला एक प्रमुख एपिजेनेटिक संशोधन है। डीएनए मिथाइलेशन सीपीजी डिन्यूक्लियोटाइड में साइटोसाइन अवशेषों के लिए मिथाइल समूहों के लिंकेज को संदर्भित करता है। इस तरह के डिन्यूक्लियोटाइड्स आमतौर पर जीन1के 5 ‘ क्षेत्र में समूहों (सीपीजी द्वीपों) में पाए जाते हैं । सामान्य कोशिकाओं में, इनमें से अधिकांश डिन्यूक्लियोटाइड्स एक अमिथीटेड स्थिति में मौजूद हैं, जो डीएनए ट्रांसक्रिप्शन की अनुमति देता है। संयोग से, कई कैंसर हाइपरमेथिलेटेड सीपीजी द्वीपों और ट्रांसक्रिप्टोमिक सिलेक्टिंग2से जुड़े होते हैं, विशेष रूप से ट्यूमर दमन जीन में, जो बदले में कैंसर3की विभिन्न पहचान में योगदान देते हैं।
दूसरी ओर, लंबे समय से interspersed परमाणु तत्वों-1 (लाइन-1एस या L1s) दोहराव, ट्रांसपोसेबल डीएनए तत्व है कि आम तौर पर CpG द्वीपों पर मिथाइलेशन के उच्च स्तर है । लाइन-1 का मिथाइलेशन स्थानांतरण को रोकता है और जीनोम अखंडता को बनाए रखने में मदद करता है। कई प्रकार के कैंसर में, लाइन-1 हाइपोमेथिलेटेड है, जिसके परिणामस्वरूप सक्रियण और बाद में रेट्रोट्रांसपोजिशन-मध्यस्थीय गुणसूत्र अस्थिरता4होती है। लाइन -1 मानव जीनोम5के लगभग 17% के लिए खातों, और इसकी मिथाइलेशन स्थिति वैश्विक जीनोमिक मिथाइलेशन स्तर6के एक संकेतक के रूप में काम कर सकते हैं । ग्लोबल लाइन-1 हाइपोमेथिलेशन को कोशिकाओं के संक्रमण से पहले ट्यूमर फेनोटाइप7में माना जाता है; इसलिए, यह जल्दी कैंसर शुरुआत के लिए एक संभावित मार्कर के रूप में वादा रखती है ।
वर्तमान में, मिथाइलेशन विश्लेषण के लिए कई तरीके हैं, जिनमें पायरोसेक्वेनसिंग, मिथाइलेशन-विशिष्ट पीसीआर, माइक्रोरेवे, और क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिसिप्रिसिप्रिशन1 शामिलहैं। अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के उपयोग ने डीएनए मिथाइलेशन का पता लगाने के लिए जीनोम-व्यापी दृष्टिकोणों को शामिल करना भी संभव बना दिया है । इनमें से कई विधियां बाइसुल्फेट-इलाज डीएनए पर भरोसा करती हैं, जिसमें अमेथेलेटेड साइटोसिन को यूरासिल में परिवर्तित कर दिया जाता है और मिथाइलेटेड साइटोसिन अपरिवर्तित रहते हैं। हालांकि, bisulfite-इलाज डीएनए के साथ काम करने से कई नुकसान होते हैं, जैसे कि यूरासिल के लिए अमेथीटेड साइटोसिन के अधूरे रूपांतरण, दृश्यों के पक्षपातपूर्ण प्रवर्धन, और अनुक्रमण त्रुटियों8।
मिथाइलेशन-विशिष्ट जांच प्रवर्धन (एमएसपीए) में, दो ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स से बनी जांच मिथाइलेशन-सेंसिटिव प्रतिबंध एंजाइम एचएआई9के लिए प्रतिबंध स्थल (जीसीजीसी) युक्त डीएनए दृश्यों को लक्षित करती है। जांच डीएनए के लिए संकरण के बाद, प्रत्येक नमूना दो सेट में विभाजित है । पहले सेट में जांच लिगेशन से गुजरना, जबकि दूसरे सेट में जांच लिगेशन से गुजरना पड़ता है और उसके बाद अमेथिलेटेड सीजीसीजी साइटों पर एचएआई-मध्यस्थता पाचन होता है । नमूनों के दोनों सेट तो पीसीआर द्वारा परिलक्षित कर रहे हैं, और उत्पादों केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अलग कर रहे हैं । अमेथाइल साइटों पर जांच एचएचएआई द्वारा पचाई जाती है और पीसीआर के दौरान परिलक्षित नहीं होती है, जिसके परिणामस्वरूप कोई चोटी संकेत नहीं होते हैं। इसके विपरीत, मेथिलेटेड साइटों पर जांच पाचन से संरक्षित होती है और इसलिए पीसीआर के दौरान परिलक्षित होती है, बाद में पीक सिग्नल10उत्पन्न होती है।
एमएसपीए वैकल्पिक तरीकों पर कई फायदे हैं। सबसे पहले, इसके लिए डीएनए (50-100 एनजी) की कम मात्रा की आवश्यकता होती है और फॉर्मलिन-फिक्स्ड पैराफिन एम्बेडेड नमूनों से डीएनए के विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है10। इसके लिए बिसुल्फेट-इलाज डीएनए की आवश्यकता नहीं है; वास्तव में, यह डीएनए के लिए अनुपयुक्त है जिसे इस तरह से संशोधित किया जाता है। कई नमूनों को एक ही समय में विश्लेषण किया जा सकता है, और MSPA जांच ऐसे डिजाइन किया जा सकता है कि वे एक साथ कई जीन या दृश्यों को लक्षित करते हैं । इसके अतिरिक्त, जांच विशिष्ट और मेथिलेटेड डीएनए के लिए संवेदनशील है के रूप में Hhaमैं प्रतिबंध साइट एक अनुक्रम है कि सीपीजी द्वीप10की खासियत है से मेल खाती है ।
इस अध्ययन में ऑस्टियोसारकोमा (ओएस) के प्रभावों की जांच की गई- व्युत्पन्न एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स (ईवीएस) लाइन-1 मिथाइलेशन पर एडीपोज ऊतक-व्युत्पन्न मेसेंचिमल स्टेम सेल (एटी-एमएससी; चित्रा 1)। ईवीएस नैनोस्केल, झिल्ली से बंधे वेसिकल्स हैं जो अधिकांश सेल प्रकारों द्वारा स्रावित होते हैं। वे11,12,माता-पिता की कोशिकाओं से प्रोटीन, लिपिड, एमआरएनए, माइक्रोआरएनए और अतिरिक्त अणुओं को ले जाते हैं। ईवीएस मध्यस्थता अंतरकोशिकीय संचार और कई रोगविज्ञानी परिस्थितियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभातेहैं 13,14. हाल ही में हुए एक अध्ययन से पता चला है कि कैंसर से व्युत्पन्न ईवीएस15प्राप्तकर्ता कोशिकाओं को सक्रिय लाइन-1 स्थानांतरित कर सकता है । पहले यह बताया गया है कि एचएएस-143बी सेल लाइन से ईवीएस अन्य आनुवंशिकप्रभाव16के अलावा एमएससी में लाइन-1 के मिथाइलेशन स्थिति को बदल सकता है ।
जब ईवी अलगाव के लिए कोशिकाओं को बढ़ाते हैं, तो विकास माध्यम में ईवी-समाप्त भ्रूण गोजातीय सीरम [एफबीएस] का उपयोग करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि एफबीएस-व्युत्पन्न ईवीएस अन्य स्रोतों से ईवीएस के साथ हस्तक्षेप कर सकता है औरपरिणाम 17,18में बाधा डाल सकता है। अल्ट्रासेंट्रिजन एफबीएस से ईवीएस को कम करने के लिए सबसे आम तरीकों में से एक है। यह अल्ट्राफिल्ट्रेशन और वाणिज्यिक ईवी-समाप्त एफबीएस19जैसे विकल्पों की तुलना में अपेक्षाकृत सरल और लागत प्रभावी प्रक्रिया है। यहां, प्रोटोकॉल यह भी दर्शाता है कि अल्ट्रासेंट्रोइफिगेनेशन द्वारा ईवी-समाप्त एफबीएस को कैसे तैयार किया जाए।
यह लेख उपरोक्त तकनीकों के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, ओएस सेल लाइन से ईवीएस के अलगाव से ओएस-ईवी में लाइन-1 के मिथाइलेशन विश्लेषण तक एमएससी(चित्रा 1)का इलाज किया गया है।
इस अध्ययन से पता चलता है कि कैसे MSPA का उपयोग एक विशिष्ट आनुवंशिक तत्व की मिथाइलेशन स्थिति का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है । लाइन-1 यहां ध्यान केंद्रित किया गया था, लेकिन जांच ज?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को हेलसिंकी परियोजना वित्तपोषण विश्वविद्यालय (WBS490302, WBS73714112) हेलसिंकी विश्वविद्यालय अस्पताल विश्वविद्यालय स्तर के स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए राज्य वित्त पोषण (Y1014SUL05, TYH2016130), फिनिश-नार्वे मेडिकल फाउंडेशन, और सेल्मा और सेल्मा द्वारा वित्त पोषित किया गया था माजा-लिसा सेलैंडर फंड (मिनर्वा फाउंडेशन) । हम संशोधित एमएसपीए प्रोटोकॉल प्रदान करने और संबंधित तकनीकी सहायता के लिए वाल्टर पाविक िक को धन्यवाद देते हैं। हम वीडियो उत्पादन के साथ हमारी मदद करने के लिए टेमू Masalin (हेलसिंकी विश्वविद्यालय) के आभारी हैं ।
1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | for NTA |
24-well plate | Corning | 3524 | MSC cell culture |
3730xl DNA Analyzer | Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific | 3730XL | |
50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | Beckman | ||
BlueStar Prestained Protein Marker | Nippon Genetics | MWP03 | WB: protein marker |
Calnexin (clone C5C9) | Cell Signaling Technology | 2679 | WB, dilution 1:800 |
CD63 (clone H5C6) | BD Biosciences | 556019 | WB, dilution 1:1000 |
Centrifuge 5702 R | Eppendorf | 5703000010 | For conditioned media and cells |
Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810000010 | For spinning down 96-well plate |
Centrifuge tube (polyallomer, 14×95 mm) | Beckman | 331374 | Ultracentrifugation |
DMEM/F-12 + GlutaMAX medium | Gibco, Life Technologies | 31331-028 | For AT-MSC culture |
Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies | 10270-106 | |
GeneScan 500 LIZ size standard | Applied Biosystems, Life Technologies | 4322682 | for capillary electrophoresis |
GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2-10RXN | for MSPA negative control |
Hi-Di formamide | Applied Biosystems, Life Technologies | 4311320 | for capillary electrophoresis |
HOS-143B cell line | ATCC | CRL-8303 | |
Hsp70 (clone 5G10) | BD Biosciences | 554243 | WB, dilution 1:1000 |
IRDye 800CW Goat anti-mouse | Li-Cor | 926-32210 | WB: secondary |
IRDye 800CW Goat anti-rabbit | Li-Cor | 926-32211 | WB: secondary |
LINE-1 probe-mix primers | IDT | Sequences in Table 1 | |
MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode | Applied Biosystems, Life Technologies | 4306737 | also requires sealing film |
Micro BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | measure protein concentration |
MiniProtean TGX 10% gels | Bio-Rad | 456-1034 | WB: gel electrophoresis |
NanoSight LM14C | Malvern Instruments | for NTA | |
Nitrocellulose membrane 0.2 µm | Bio-Rad | 1620112 | WB: protein transfer |
NucleoSpin Tissue XS | Macherey-Nagel | 740901.50 | for DNA extraction |
Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | WB: blocking, antibodies |
PBS, 1X | Corning | 21-040-CVR | |
Penicillin-streptomycin | Gibco, Life Technologies | DE17-602E | Antibiotics for culture media |
Protein LoBind tube, 0.5 mL | Eppendorf | 22431064 | For storing Evs |
REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit | Li-Cor | 926-11015 | WB: total protein staining |
RKO cell line | ATCC | CRL-2577 | for MSPA positive control |
RPMI medium 1640 + GlutaMAX | Gibco, Life Technologies | 61870-010 | For HOS-143B cell culture |
SALSA MLPA HhaI enzyme | MRC-Holland | SMR50 | |
SALSA MLPA reagent kit | MRC-Holland | EK1-FAM | |
SALSA MLPA P300 probe-mix | MRC-Holland | P300-100R | |
Swinging rotor SW-28 | Beckman Coulter | 342207 | Ultracentrifugation |
Syringe filter, 0.22 µm | Jet Biofil | FPE-204-030 | sterile filtering FBS |
Tecnai 12 | FEI Company | equipped with Gatan Orius SC 1000B CCD-camera (Gatan Inc., USA); for TEM |
|
TBS, 1X tablets | Medicago | 09-7500-100 | WB: buffer |
Trans-Blot Turbo | Bio-Rad | WB: transfer | |
Thermal cycler | ThermoFisher Scientific | TCA0096 | |
TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | for trypsinization of cells |
TSG101 (clone 4A10) | Sigma | SAB2702167 | WB, dilution 1:500 |