Retrograde Tracing von Drosophila Embryonal Motor Neuronen mit lipophilen fluoreszierenden Farbstoffen
Summary
Wir beschreiben eine Methode zur retrograden Rückverfolgung der embryonalen motorischen Neuronen Von Drosophila mit lipophilen Fluoreszenzfarbstoffen.
Abstract
Wir beschreiben eine Technik zur retrograden Kennzeichnung von motorischen Neuronen in Drosophila. Wir verwenden einen ölaufgelösten lipophilen Farbstoff und liefern ein kleines Tröpfchen an ein embryonales Filetpräparat durch einen Mikroinjektor. Jedes Motorneuron, dessen Membran vom Tröpfchen kontaktiert wird, kann dann schnell beschriftet werden. Einzelne Motorneuronen werden kontinuierlich beschriftet, so dass feine Strukturdetails klar visualisiert werden können. Da lipophile Farbstoffe in verschiedenen Farben erhältlich sind, bietet die Technik auch ein Mittel, um benachbarte Neuronen in mehrfarbig beschriftet zu bekommen. Diese Tracing-Technik ist daher nützlich für die Untersuchung der neuronalen Morphogenese und synaptischen Konnektivität im motorischen Neuronensystem von Drosophila.
Introduction
Das embryonale motorische Neuronensystem von Drosophila bietet ein leistungsfähiges experimentelles Modell zur Analyse der Mechanismen, die der Entwicklung des Zentralnervensystems (ZNS)1,2,3zugrunde liegen. Das motorische Neuronensystem ist für biochemische, genetische, bildgebende und elektrophysiologische Techniken zugänglich. Mit den Techniken können genetische Manipulationen und funktionelle Analysen auf der Ebene der einzelnen motorischen Neuronen2,4,5,6durchgeführt werden.
Während der frühen Entwicklung des Nervensystems, Neuroblasten teilen und erzeugen eine große Anzahl von Glia und Neuronen. Die räumlich-zeitliche Beziehung zwischen der Delamination und dem Genexpressionsprofil von Neuroblasten wurde zuvor im Detail untersucht7,8,9. Im Falle des motorischen Neuronsystems wurde die Bildung embryonaler neuromuskulärer Knoten (NMJ) mit dem aCC (vordere Eckzelle), RP2 (Rohgarnelen 2) und RP5 Motorneuronen2,10ausgiebig untersucht. Wenn das RP5-Motorneuron beispielsweise eine entstehende synaptische Verbindung bildet, werden die präsynaptischen und postsynaptischen Filopodia11,12,13vermischt. Eine solche direkte zelluläre Kommunikation ist entscheidend, um die NMJ-Bildung zu initiieren. Im Gegensatz zu dem, was wir über die peripheren Nervenzweige wissen, ist unser Wissen darüber, wie motorische Dendriten eine synaptische Konnektivität innerhalb des ZNS initiieren, immer noch primitiv.
In diesem Bericht stellen wir eine Technik vor, die eine retrograde Kennzeichnung von motorischen Neuronen in Embryonen mittels mikropipettevermittelter Abgabe lipophiler Farbstoffe ermöglicht. Diese Technik ermöglicht es uns, die 38 motorischen Neuronen zu verfolgen, die jede der 30 Körperwandmuskeln in einem Hemi-Segment bei 15 h nach Dereiablage (AEL)14innervieren. Mit dieser Technik hat unsere Gruppe zahlreiche Funktionsverstärkungs-/Funktionsverlust-Allele15,16,17gründlich untersucht. Wir haben vor kurzem die molekularen Mechanismen entwirrt, die die Initiierung der motorischen Dendritenkonnektivität vorantreiben, und gezeigt, dass eine Dscam1-Dock-Pak-Interaktion den Ort des Dendritenauswachsens im aCC-Motorneuron17definiert. Im Allgemeinen ist diese Technik anpassungsfähig für die phänotypische Analyse von embryonalen motorischen Neuronen in wilden Typ- oder mutierten Stämmen, was unsere Fähigkeit verbessert, neue Einblicke in das funktionelle Design des Drosophila-Nervensystems zu geben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Verwendung von Farbstoffkennzeichnungen zur Untersuchung der neuronalen Morphologie hat mehrere Vorteile gegenüber genetischen Zelletikettierungstechniken. Die Färbeetikettierungstechnik kann den Zeitaufwand für die Etikettierung und Abbildung der Morphologien von motorischen Neuronen minimieren. Der Färbeetikettierungsprozess ist recht schnell, da er weniger als 2 h dauert und es uns ermöglicht, die Umrisse neuronaler Projektionen zu definieren. Alternativ kann man das aCC-Motorneuron visualisieren, indem man e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Mitgliedern des Kamiyama Lab für die Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde von einem NIH R01 NS107558 (nach M.I., K.B. und D.K.) unterstützt.
Materials
| 10x objective lens | Nikon | Plan | |
| 40x water-immersion lens | Nikon | NIR Apo | |
| Capillary tubing | Frederick Haer&Co | 27-31-1 | |
| Confocal microscope | Andor | N/A | Dragonfly Spinning disk confocal unit |
| Cover glass | Corning | 22×22 mm Square #1 | |
| DiD | ThermoFisher | V22886 | |
| DiI | ThermoFisher | V22888 | |
| DiO | ThermoFisher | V22887 | |
| Dissecting microscope | Nikon | N/A | SMZ-U |
| Double Sided Tape | Scotch | 665 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Sci. | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Egg collection cage | FlyStuff | 59-100 | |
| FemtoJet 5247 | Eppendorf | discontinued | FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021) |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-225 | |
| Micropipette beveler | Sutter | BV-10-B | |
| Needle puller | Narishige | PC-100 | |
| Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets | FlyStuff | 47-102 | |
| Nylon Net Filter | Millipore | ||
| Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Any EM grades |
| PBS | Roche | 11666789001 | Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 146 4510 | Wetting agent |
| Upright fluorescence microscope | Nikon | N/A | Eclipse Ci with a LED light source |
| Vinyl Electrical Tape | Scotch | 6143 | |
| VWR Cell Strainers | VWR | 10199-659 | |
| Yeast | FlyStuff | 62-103 | Active dry yeast (RED STAR) |
Referências
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