Транскриптом-широкое профилирование белково-РНК-взаимодействий путем перекрестного связывания и иммунопреципиентации при посредничестве FLAG-Biotin Tandem Purification
Summary
Здесь мы представляем модифицированный протокол CLIP-seq под названием FbioCLIP-seq с очисткой тандема FLAG-biotin для определения целей РНК-связывающих белков (RBPs) в клетках млекопитающих.
Abstract
РНК и РНК-связывающие белки (РБП) контролируют несколько биологических процессов. Пространственное и временное расположение РНК и РРБ лежит в основе деликатного регулирования этих процессов. Разработана стратегия под названием CLIP-seq (перекрестное связывание и иммунопреципиентация) для захвата эндогенных белково-РНК-взаимодействий с УФ-перекрестными соединениями с последующим иммунопреципитацией. Несмотря на широкое использование традиционного метода CLIP-seq в исследовании RBP, метод CLIP ограничен наличием высококачественных антител, потенциальными загрязняющими веществами из copurified RBPs, требованием манипуляции изотопами и потенциальной потерей информации во время утомительной экспериментальной процедуры. Здесь мы описываем модифицированный метод CLIP-seq под названием FbioCLIP-seq с использованием тандема FLAG-biotin. Благодаря тандемной очистке и строгим условиям мытья удаляются почти все взаимодействующие РНК-связывающие белки. Таким образом, рнк, взаимодействующие косвенно при посредничестве этих copurified RBPs, также сокращаются. Наш метод FbioCLIP-seq позволяет эффективно обнаруживать прямые РНК, связанные с белком, без процедур SDS-PAGE и мембранной передачи без изотопов и без белка.
Introduction
РНК и РНК-связывающие белки (РБП) контролируют различные клеточные процессы, включая сращивание, перевод, рибосомный биогенез, эпигенетическуюрегуляции и переход судьбы клеток 1,2,3,4,5,6. Тонкие механизмы этих процессов зависят от уникального пространственного и временного расположения РНК и РРБ. Поэтому важным шагом на пути к пониманию регулирования РНК на молекулярном уровне является выявление позиционной информации о связывающих участках РРБ.
Разработана стратегия, именуемая перекрестными соединениями и иммунопреципитацией (CLIP-seq) для захвата белково-РНК-взаимодействий с УФ-перекрестными соединениями с последующим иммунопреципитациейбелка интереса 7. Ключевой особенностью методологии является индукция ковалентных перекрестных связей между РНК-связывающим белком и его непосредственно связанными молекулами РНК (в пределах 1 евро) путемУФ-облучения 8. Следы RBP могут быть определены кластеризацией тегов CLIP и пиковым вызовом, разрешение которого обычно составляет 30–60 nt. Кроме того, обратный этап транскрипции CLIP может привести к indels (вставки или удаления) или замены кросс-связывающих сайтов, что позволяет идентифицировать белковые связывающие сайты на РНК при одном нуклеотидном разрешении. Трубопроводы, такие как Novoalign и CIMS, были разработаны для анализа результатов секвенирования высокой пропускной способности CLIP-seq8. Несколько модифицированных методов CLIP-seq также были предложены, в том числе индивидуальное нуклеотидное разрешение кросс-ссылок и иммунопреципиентации (iCLIP), расширенный CLIP (eCLIP), irCLIP, и фотоактивируемый рибонуклеозид-улучшенной перекрестной связи и иммунопреципиентации (PAR-CLIP)9,10,11,12.
Несмотря на широкое использование традиционных методов CLIP-seq при изучении RBPs, методы CLIP имеют несколько недостатков. Во-первых, утомительный денатурированный гель электрофорез и процедура переноса мембраны могут привести к потере информации и вызвать ограниченную сложность последовательности. Во-вторых, белок конкретных антител на основе метода CLIP может тянуть вниз белковый комплекс вместо одного целевого белка, что может привести к ложноположим белково-РНК взаимодействий с copurified RBPs. В-третьих, антитела на основе стратегии требует большого количества высококачественных антител, что делает применение этих методов недостаточным для изучения RBPs без высококачественных антител доступны. В-четвертых, традиционный метод CLIP требует радиозаклейм АТФ для обозначения связанных с белком РНК.
Высокое сродство стрептавидина к биотинилированным белкам делает его очень мощным подходом к очистке конкретных белков или белковых комплексов. Эффективное биотинилирование белков, несущих искусственную пептидную последовательность эктопически выраженной бактериальной биотиновой лигазой BirA в клетках млекопитающих, делает его эффективной стратегией для выполнения биотиновой очистки in vivo13. Мы разработали модифицированный метод CLIP-seq под названием FbioCLIP-seq(FLAG- Bioолово-опосредованное Cross-lчернила и Immuno p recipitation с последующим секвенированием высокой пропускной способности) с использованием FLAG-биотина тегатандема очистки 14 (Рисунок 1). Благодаря тандемной очистке и строгим условиям мытья, почти все взаимодействующие RBPs удаляются(рисунок 2). Строгие условия мытья также позволяют обойти SDS-PAGE и мембраны передачи, которая является трудоемкой и технически сложной задачей. И подобно eCLIP и IRCLIP, метод FbioCLIP-seq не имеет изотопов. Пропуск геля на ход и перенос шагов позволяет избежать потери информации, сохраняет аутентичные взаимодействия белка и РНК нетронутыми, а также увеличивает сложность библиотеки. Кроме того, высокая эффективность системы маркировки делает ее хорошим выбором для RBPs без высококачественных антител доступны.
Здесь мы предоставляем пошаговое описание протокола FbioCLIP-seq для клеток млекопитающих. Короче говоря, клетки связаны между собой 254 нм УФ, а затем клеточный лиз и FLAG иммунопреципитации (FLAG-IP). Далее белково-РНК-комплексы дополнительно очищаются путем захвата биотинов, а РНК фрагментированы частичным пищеварением с помощью MNase. Затем РНК, связанная с белком, дефосфорилируется и привязается к связующим звену 3′ 5′ РНК linker добавляется после РНК фосфорилируется с PNK и eluted по proteinase K пищеварения. После обратной транскрипции сигналы РНК, связанные с белком, усиливаются ПЦР и очищаются путем очистки геля агарозы. Два RBPs были выбраны в качестве примера fbioCLIP-seq результат. LIN28 является хорошо охарактеризованным РНК-связывающим белком, участвующим в созревании микроРНК, переводе белка иперепрограммировании клеток 15,16,17. WDR43 является WD40 домен-содержащий белок считается координировать рибосомы биогенез, эукариотической транскрипции, и эмбриональных стволовых клеток плюрипотентностиуправления 14,18. В соответствии с ранее сообщенные результаты для LIN28 с CLIP-seq, FbioCLIP-seq показывает связывающие сайты LIN28 на “GGAG” мотивы в микроРНК мир-let7g и mRNAs16,19 (Рисунок 3). WDR43 FbioCLIP-seq также определил связывающее предпочтение WDR43 с 5′ внешними транскрибированными spacers (5′-ETS) предварительно rRNAs20 (Рисунок 4). Эти результаты подтверждают надежность метода FbioCLIP-seq.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы представляем модифицированный метод CLIP-seq под названием FbioCLIP-seq, воспользовавшись системой двойной маркировки FLAG-biotin для выполнения тандемной очистки белково-РНК-комплексов. Система двойной маркировки FLAG-biotin была показана, что была мощна в определять взаимодействия про?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Грантовая поддержка предоставляется Национальной программой фундаментальных исследований Китая (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), Национальным фондом естественных наук Китая (31630095) и Центром наук о жизни при Университете Цинхуа.
Materials
| Equipment | |||
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 HybrilLinker | |
| Affinity Purification Beads | |||
| ANTI-FLAG beads | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Streptavidin beads | Invitrogen | 112.06D | |
| Reagents | |||
| 10x PBS | Gibco | 70013032 | |
| 3 M NaOAc | Ambion | AM9740 | |
| 3 x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| CIP | NEB | M0290S | CIP buffer is in the same package. |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Gel purification kit | QIAGEN | 28704 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 449172 | |
| MNase | NEB | M0247S | |
| NP-40 | Amresco | M158-500ML | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Porteinase K | TAKARA | 9033 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | 0492S | |
| reverse trancriptase (SupperScriptIII) | Invitrogen | 18080093 | |
| RNA isolation reagent (Trizol) | Invitrogen | 15596018 | |
| RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | PNK buffer is in the same package. |
| T4 RNA ligaes | ThermoFisher | EL0021 | T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package. |
| T4 RNA ligase2, truncated | NEB | M0242S | T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package. |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200072 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | |
| mESC culture medium | |||
| DMEM (80%) | Gibco | 11965126 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| FCS (15%) | Hyclone | ||
| Glutamax (1%) | Gibco | 35050061 | |
| LIF | purified recombinant protein; 10,000 fold dilution | ||
| NEAA (1%) | Gibco | 11140050 | |
| Nucleoside mix (1%) | Millipore | ES-008-D | |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140122 | |
| Kit | |||
| DNA gel extraction kit | QIAGEN | 28704 |
Referências
- Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
- Guallar, D., et al. RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells. Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).
- Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3′ Ends. Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).
- Wei, C., et al. RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes. Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).
- Kim, D. S., et al. Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21. Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).
- Yao, R. W., et al. Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus. Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).
- Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
- Moore, M. J., et al. Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis. Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).
- Konig, J., et al. iCLIP–transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).
- Zarnegar, B. J., et al. irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions. Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP–a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. Journal of Visualized Experiments. (41), e2034 (2010).
- de Boer, E., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Bi, X., et al. RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control. Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).
- Heo, I., et al. TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation. Cell. 138 (4), 696-708 (2009).
- Cho, J., et al. LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Zhao, C., et al. Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development. PLoS Genetics. 10 (1), 1004074 (2014).
- Wilbert, M. L., et al. LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance. Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).
- Hunziker, M., et al. UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly. Nature Communications. 7, 12090 (2016).
- Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).
- Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
- Aktas, T., et al. DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome. Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).
- Xu, Q., et al. Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis. Journal of Visualized Experiments. (147), e59681 (2019).
