Création de systèmes de dimerisation des protéines hautement spécifiques induits par des produits chimiques par stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Un-Domain Un-Domain Un-Domain Body Library
Summary
La création de systèmes de dimerisation des protéines induits chimiquement avec l’affinité et la spécificité souhaitées pour n’importe quelle petite molécule donnée ligand aurait beaucoup d’applications biologiques de détection et d’actionnement. Ici, nous décrivons une méthode efficace et généralisable pour l’ingénierie de novo des systèmes de dimerization induits chimiquement par l’intermédiaire de la sélection progressive d’une bibliothèque d’anticorps combinatorial de phage-affiché.
Abstract
Les événements de dimerisation des protéines qui se produisent seulement en présence d’un ligand à petites molécules permettent le développement de biocapteurs à petites molécules pour la dissection et la manipulation des voies biologiques. À l’heure actuelle, il n’existe qu’un nombre limité de systèmes de dimerisation induite par des produits chimiques (CID) et l’ingénierie de nouveaux systèmes avec la sensibilité et la sélectivité souhaitées pour des ligands spécifiques à petites molécules demeure un défi dans le domaine de l’ingénierie des protéines. Nous décrivons ici une méthode de criblage à haut débit, combinatorial binders-enabled sélection de CID (COMBINES-CID), pour l’ingénierie de novo des systèmes CID applicables à une grande variété de ligands. Cette méthode utilise la sélection en deux étapes d’une bibliothèque de nanobody combinatorial phage-affichée pour obtenir 1) « liants d’ancrage » qui se lient d’abord à un ligand d’intérêt et puis 2) « liants de dimerisation » qui se lient seulement aux complexes liants-ligands d’ancrage. Pour sélectionner les liants d’ancrage, une bibliothèque combinatoire de plus de 109 nanocorps randomisés de région de complémentarité (CDR) est examinée à l’autorisation d’un ligand biotinylated et les hits sont validés avec le ligand non étiqueté par interférométrie biocouche (BLI). Pour obtenir des classeurs de dimerisation, la bibliothèque nanobody est examinée avec des complexes de liant d’ancrage-ligand comme cibles pour le criblage positif et les liants d’ancrage non liés pour le criblage négatif. COMBINES-CID est largement applicable à certains liants CID avec d’autres immunoglobulines, non-immunoglobuline, ou des échafaudages conçus par calcul pour créer des biocapteurs pour la détection in vitro et in vivo de médicaments, métabolites, molécules de signalisation, etc.
Introduction
Les systèmes CID, dans lesquels deux protéines se dimerisent seulement en présence d’un ligand à petites molécules (figure 1), offrent des outils polyvalents pour disséquer et manipuler les voies métaboliques, de signalisation et autres voies biologiques1. Ils ont démontré le potentiel dans l’actionnement biologique, tel que l’activation de cellule T drogue-commandée2 et l’apoptose3,4, pour améliorer l’innocuité et l’efficacité de la thérapie de cellule T adoptive. En outre, ils fournissent une nouvelle méthodologie pour la détection in vivo ou in vitro des cibles de petites molécules. Par exemple, les protéines CID peuvent être génétiquement fusionnées avec des systèmes de rapporteur de fluorescence (p. ex., transfert d’énergie par résonance fluorescence (FRET)5 et protéines fluorescentes permutées circulairement)6 pour des mesures in vivo en temps réel, ou servir de réactifs d’affinité pour les analyses immunosorbent liées à l’enzyme sandwich (ELISA).
Malgré leurs applications étendues, la création de nouveaux systèmes CID qui peuvent être contrôlés par un ligand à petites molécules donnée présente des défis majeurs. Les méthodes établies d’ingénierie de liant de protéine comprenant la vaccinationanimale 7,la sélection in vitro8,9, et la conception de protéine computationnelle10 peuvent produire des protéines de liaison de ligand qui fonctionnent par l’intermédiaire des interactions binaires de protéine-ligand. Cependant, ces méthodes ont des difficultés à créer un complexe de CID ternaire induit par ligand. Certaines méthodes créent CID en reliant chimiquement deux ligands qui se lient indépendamment aux mêmes protéines ou différentes11,12,13,14,15,16 ou s’appuient sur la sélection de protéines de liant tels que les anticorps ciblant préexistant sa petite molécule-protéines complexes17,18, et ont donc un choix limité de ligands.
Nous avons récemment développé une combinatorial binders-enabled sélection de CID (COMBINES-CID) méthode pour l’ingénierie de novo des systèmes CID19. Cette méthode peut obtenir la grande spécificité de la dimerisation induite par ligand (par exemple, une dissociation de liant d’ancrage-dimerisation constante, KD (sans ligand)/KD (avec ligand) -gt; 1.000). La spécificité de la dimerisation est obtenue à l’aide de liants d’ancrage avec des sites de liaison flexibles qui peuvent introduire des changements conformationnels lors de la liaison ligand, fournissant une base pour la sélection de liants sélectifs conformationnellement ne reconnaissant que les liants d’ancrage ligand-liés. Nous avons démontré une preuve de principe en créant des hétérodimères induits par le cannabidiol (CBD) de nanocorps, un fragment d’anticorps fonctionnel de 12 à 15 kDa à partir de camélidés comprenant un échafaudage universel et trois boucles CDR flexibles (Figure 2)20, qui peuvent former une poche de liaison avec des tailles adaptables pour les épitopes de petites molécules21,22. Notamment, la sélection in vitro d’une bibliothèque de protéines combinatoires devrait être rentable et généralisable pour l’ingénierie CID parce que la même bibliothèque de haute qualité peut être appliquée à différents ligands.
Dans ce protocole et cette vidéo, nous nous concentrons sur la description de la sélection in vitro en deux étapes et de la validation des liants d’ancrage (figure 3A) et des liants de dimerisation (figure 3B) en examinant la bibliothèque combinatoire nanobody avec une diversité supérieure à 109 en utilisant le CBD comme cible, mais le protocole devrait s’appliquer à d’autres bibliothèques de protéines ou à des cibles à petites molécules. Le dépistage des liants CID prend habituellement de 6 à 10 semaines(figure 4).
Protocol
Representative Results
Discussion
Il est essentiel de choisir les concentrations correctes de bibliothèques de phage d’entrée pour différentes séries de biopanning. Nous avons généralement commencé à partir d’une bibliothèque d’entrée de 12101013 particules de phage avec une diversité de ’109, permettant ‘100 à 1.000 copies de chaque clone de phage pour être présenté dans le résultat de traction vers le bas. Si la concentration de phages dans un test contraignant est trop élevée ou faible, la probabilit?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le University of Washington Innovation Award (à L.G.), une subvention des National Institutes of Health des États-Unis (1R35GM128918 à L.G.), et un fonds de démarrage de l’Université de Washington (à L.G.). H.J. a reçu le soutien d’une bourse de premier cycle de la Washington Research Foundation. K.W. a été soutenu par une bourse de premier cycle de l’Université de Washington Institute for Protein Design.
Materials
| 1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution | Thermo Fisher Scientific | 34029 | |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff) | Millipore | UFC900324 | |
| Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | |
| BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1KG | |
| CM13 Helper phage | Antibody Design Labs | PH020L | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | Alfa Aesar | A11090 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Fast DNA Ladder | New England Biolabs | N3238S | |
| FastDigest BglI | Thermo Fisher Scientific | FD0074 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-1 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 28989335 | |
| HiPrep 26/10 Desalting Column | GE Healthcare | 17508701 | |
| HisTrap-FF-1ml | GE Healthcare | 11000458 | |
| Imidazole | Alfa Aesar | 161-0718 | |
| IPTG | Thermo Fisher Scientific | 34060 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher Scientific | BP906-5 | |
| M13 Major Coat Protein Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53004 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-500G | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | |
| Nunc MaxiSorp | Thermo Fisher Scientific | 44-2404-21 | |
| Octet RED96 | ForteBio | N/A | |
| pADL-23c Phagemid Vector | Antibody Design Labs | PD0111 | |
| PEG-6000 | Sigma-Aldrich | 81260-1KG | |
| Platinum SuperFi DNA Polymerase | Invitrogen | 12351010 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | K310001 | |
| QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 27704 | |
| Recovery Medium | Lucigen | 80026-1 | |
| SpectraMax Plus 384 | Molecular Devices | N/A | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | |
| Super Streptavidin (SSA) Biosensors | ForteBio | 18-5057 | |
| Superdex 75 increase 10/300 GL Column | GE Healthcare | 28-9909-44 | |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | 15224-025 | |
| TG1 Electrocompetent Cells | Lucigen | 60502-1 | |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283-100mL | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | BP9726-5 | |
| Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89882 |
Referências
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