Creazione di sistemi di dimerizzazione delle proteine altamente specifici indotta chimicamente mediante la selezione stepwise di phage di una biblioteca combinatoria di anticorpi a dominio singolo
Summary
La creazione di sistemi di dimerizzazione delle proteine indotta chimicamente con l’affinità e la specificità desiderate per ogni piccolo ligando molecolare avrebbe molte applicazioni biologiche di rilevamento e attuazione. Qui, descriviamo un metodo efficiente e generalizzabile per l’ingegneria de novo di sistemi di dimerizzazione chimicamente indotti attraverso la selezione graduale di una libreria di anticorpi combinatori combinatori e di foragi.
Abstract
Gli eventi di dimerizzazione delle proteine che si verificano solo in presenza di un ligando di piccole molecole consentono lo sviluppo di biosensori di piccole molecole per la dissezione e la manipolazione dei percorsi biologici. Attualmente, ne esistono solo un numero limitato di sistemi di dimerizzazione chimicamente indotti (CID) e l’ingegneria di nuovi sistemi con la sensibilità e la selettività desiderate per specifici ligandi di piccole molecole rimane una sfida nel campo dell’ingegneria delle proteine. Qui descriviamo un metodo di screening ad alta produttività, combinatorial binders-enabled selezione di CID (COMBINES-CID), per l’ingegneria de novo di sistemi CID applicabili a una grande varietà di ligandi. Questo metodo utilizza la selezione in due passaggi di una libreria nanobody combinatorial visualizzata da fago per ottenere 1) “leganti di ancoraggio” che prima si legano a un ligando di interesse e poi 2) “leganti di dimerizzazione” che si legano solo ai complessi binder-ligando di ancoraggio. Per selezionare i leganti di ancoraggio, una libreria combinatoria di oltre 109 nanocorpi randomizzati di regioni (CDR) viene sottoposta a screening con un legamento biotinylato e gli colpi vengono convalidati con il legamento senza etichetta tramite interferometria biostrato (BLI). Per ottenere leganti di dimerizzazione, la libreria nanobody viene sottoposta a screening con complessi di legatrice-ligando di ancoraggio come obiettivi per lo screening positivo e i leganti di ancoraggio non associati per lo screening negativo. COMBINES-CID è ampiamente applicabile per selezionare leganti CID con altri immunoglobulina, non immunoglobulina, o scaffold progettati computazionalmente per creare biosensori per il rilevamento in vitro e in vivo di farmaci, metaboliti, molecole di segnalazione, ecc.
Introduction
I sistemi CID, in cui due proteine si dimerdano solo in presenza di un ligando di piccole molecole (Figura 1), offrono strumenti versatili per sezionare e manipolare metaboliche, segnalazioni e altre vie biologiche1. Hanno dimostrato il potenziale nell’attuazione biologica, come l’attivazione delle cellule T controllate da farmaci2 e l’apoptosi3,4, per migliorare la sicurezza e l’efficacia della terapia con cellule T adottiva. Inoltre, forniscono una nuova metodologia per il rilevamento in vivo o in vitro di bersagli di piccole molecole. Ad esempio, le proteine CID possono essere geneticamente fuse con sistemi di segnalazione di fluorescenza (ad esempio, il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET)5 e proteine fluorescenti permutate in modo circolare)6 per misurazioni in vivo in tempo reale, o servono come reagenti di affinità per gli immunosbenatori simili a assaggi di assaggio (ELISALISA).
Nonostante le loro ampie applicazioni, la creazione di nuovi sistemi CID che possono essere controllati da un determinato ligando di piccole molecole ha grandi sfide. Metodi di ingegneria dei leganti proteici stabiliti, tra cui l’immunizzazione animale7, la selezione in vitro8,9e il disegno delle proteine computazionali10 possono generare proteine leganti che funzionano tramite interazioni binarie proteina-ligando. Tuttavia, questi metodi hanno difficoltà a creare un complesso CID ternario indotto dal ligando. Alcuni metodi creano CID collegando chimicamente due ligando che si legano in modo indipendente alle stesse proteine11,12, 13,14,15,16 o si basano sulla selezione di proteine leganti come anticorpi che colpiscono piccoli complessi molecolari-proteine preesistenti17,18, e quindi hanno una scelta limitata di ligandi.
Recentemente abbiamo sviluppato un metodo combinatorial binders-enabled di CID (COMBINES-CID) per l’ingegneria de novo dei sistemi CID19. Questo metodo può ottenere l’elevata specificità della dimerizzazione indotta dal ligando (ad esempio, una costante di dissociazione del legante di ancoraggio, KD (senza ligando)/KD (con ligando) > 1.000). La specificità della dimerizzazione si ottiene utilizzando leganti di ancoraggio con siti di legame flessibili che possono introdurre cambiamenti conformazionali al momento della legatura del ligando, fornendo una base per la selezione di leganti conformazionali selettivi che riconoscono solo leganti legati al ligando. Abbiamo dimostrato una prova di principio creando eterodimeri indotta da cannabidiolo (CBD) di nanocorpi, un frammento di anticorpi funzionale da 12-15 kDa da camelid che comprende un ponteggio universale e tre anelli CDR flessibili (Figura 2)20, che possono formare una tasca legante adattabile con epitopi di piccole molecole21,22. In particolare, la selezione invitro di una biblioteca proteica combinatoria dovrebbe essere conveniente e generalizzabile per l’ingegneria del CID, poiché la stessa libreria di alta qualità può essere applicata a diversi ligandi.
In questo protocollo e video, ci concentriamo sulla descrizione della selezione in vitro in due fasi e della convalida dell’ancora (Figura 3A) e dei leganti di dimerizzazione (Figura 3B) esaminando la biblioteca combinatoria di nanobody con una diversità superiore a 109 utilizzando il CBD come obiettivo, ma il protocollo dovrebbe essere applicabile ad altre librerie proteiche o a bersagli di piccole molecole. Lo screening dei leganti CID richiede solitamente 6-10 settimane (Figura 4).
Protocol
Representative Results
Discussion
È fondamentale scegliere le giuste concentrazioni di librerie di faghi di input per diversi cicli di biopanning. In genere siamo partiti da una libreria di input di 10-1013 particelle di fago con una diversità >109, consentendo la presentazione di 100-1.000 copie di ogni clone di fago nel saggio pull-down. Se la concentrazione di fago in un saggio vincolante è troppo alta o bassa, la probabilità di legame non specifico o perdita di cloni positivi aumenterà. La selezione del legante d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dall’University of Washington Innovation Award (a L.G.), una sovvenzione degli U.S. National Institutes of Health (1R35GM128918 a L.G.), e da un fondo di avvio dell’Università di Washington (a L.G.). H.J. è stato sostenuto da una borsa di studio universitaria della Washington Research Foundation. K.W. è stato sostenuto da una borsa di studio universitaria dell’Università di Washington Institute for Protein Design.
Materials
| 1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution | Thermo Fisher Scientific | 34029 | |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff) | Millipore | UFC900324 | |
| Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | |
| BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1KG | |
| CM13 Helper phage | Antibody Design Labs | PH020L | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | Alfa Aesar | A11090 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Fast DNA Ladder | New England Biolabs | N3238S | |
| FastDigest BglI | Thermo Fisher Scientific | FD0074 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-1 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 28989335 | |
| HiPrep 26/10 Desalting Column | GE Healthcare | 17508701 | |
| HisTrap-FF-1ml | GE Healthcare | 11000458 | |
| Imidazole | Alfa Aesar | 161-0718 | |
| IPTG | Thermo Fisher Scientific | 34060 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher Scientific | BP906-5 | |
| M13 Major Coat Protein Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53004 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-500G | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | |
| Nunc MaxiSorp | Thermo Fisher Scientific | 44-2404-21 | |
| Octet RED96 | ForteBio | N/A | |
| pADL-23c Phagemid Vector | Antibody Design Labs | PD0111 | |
| PEG-6000 | Sigma-Aldrich | 81260-1KG | |
| Platinum SuperFi DNA Polymerase | Invitrogen | 12351010 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | K310001 | |
| QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 27704 | |
| Recovery Medium | Lucigen | 80026-1 | |
| SpectraMax Plus 384 | Molecular Devices | N/A | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | |
| Super Streptavidin (SSA) Biosensors | ForteBio | 18-5057 | |
| Superdex 75 increase 10/300 GL Column | GE Healthcare | 28-9909-44 | |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | 15224-025 | |
| TG1 Electrocompetent Cells | Lucigen | 60502-1 | |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283-100mL | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | BP9726-5 | |
| Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89882 |
Referências
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